NIBS张昱《Cell Res》解析CRISPR/Cas9脱靶效应

　　

生物通报道：2014年7月1日，中国医学科学院和北京生命科学研究所（NIBS）的研究人员，以“Letter to the Editor”的形式在知名期刊《Cell Research》发表了关于全基因组识别人类基因组CRISPR/Cas9脱靶效应的最新研究成果，文章题为“Genome-wide identification of CRISPR/Cas9 off-targets in human genome”。 在本文准备投稿期间，《Nature Biotechnology》杂志4月刊和5月刊分别发表的两篇文章，也得出了相同的结论。相关新闻：检测CRISPR/Cas9基因编辑系统的副作用。

该报道的通讯作者是北京生命科学研究所研究员张昱博士，他分别于1996年和1999年在北京师范大学生物系获学士和硕士学位，2004年博士毕业于瑞士弗雷德里克-米歇尔研究所。2004年至2005年在瑞士弗雷德里克-米歇尔研究所从事博士后研究，2005年至2012年在哈佛大学医学院免疫疾病研究所从事博士后工作。2013年至今为北京生命科学研究所研究员。主要利用并完善已经建立的基因组高通量染色体转位测序方法来研究影响染色体转位发生的新因子。同时也使用其他多种手段，并利用人类细胞和动物模型研究癌症起始和发展中导致基因组不稳定的分子机制。曾在Nature、Nat Immunol、Cell、PNAS、PLOS Genet、Mol Cell Biol、JBC、EMBO J等国际知名期刊发表论文多篇。

在最近几十年，基因组编辑技术（建立在基因靶向修饰的基础上，对生物基因组进行改造的一项新技术）得到了迅速的发展。其中，利用归巢内切酶（HEases）、锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和最近的CRISPR/Cas9系统对各种生物基因组位点进行位点特异性裂解，不仅在实验室中被广泛应用，而且也应用于转化研究。

基因组编辑的核心问题是，如何实现特定基因组序列的特异性识别。在HEases、ZFNs和TALENs的情况下，可通过核苷酸和蛋白质序列之间的特定分子间相互作用实现，而对于CRISPR/Cas9来说，特异性是由于CRISPR RNA (crRNA)及其识别序列之间的Watson-Crick碱基配对。

尽管诸多的努力一直都专注于优化CRISPR/Cas9在各种生物体中的打靶和裂解效能，但是对脱靶效应的研究相对较少。关于基因组编辑的一个主要担忧是，编辑酶的潜在脱靶效应会带来意想不到的基因组不稳定性，如突变和染色体易位。

在这项研究中，研究人员利用一种公正的全基因组ChIP-seq方法，分析了人类基因组中CRISPR/Cas9的结合脱靶效应。令人惊讶的是，虽然Cas9能够以一种sgRNA特异性方式，结合各种包含PAM的基因组序列和保守种子序列，但与其他基因组编辑酶（如HEases、ZFNs和TALENs）相比，它的裂解脱靶是有限的。这很大程度上是因为，靶序列退火步骤额外参与活化CRISPR/Cas9复合体在其靶点上的裂解活动。另一方面，sgRNA特异性脱靶结合活性，可能会显著影响其他最近开发的方法，这些方法将CRISPR/Cas9的核苷酸序列结合特异性，与其他非裂解相关的功能（如转录调控和荧光标记）相结合。

研究证实，在人类基因组中CRISPR/Cas9具有crRNA特异性脱靶结合活性。然而，大多数的这些结合脱靶效应，在体内和体外都不能有效地裂解，表明人类基因组中的CRISPR/Cas9脱靶裂解活性是很有限的。

（生物通：王英）

生物通推荐原文：
1、 Jinzhi Duan, Guangqing Lu, Zhan Xie, Mingliang Lou, Jiao Luo, Lei Guo and Yu Zhang. Genome-wide identification of CRISPR/Cas9 off-targets in human genome. Cell Research advance online publication 1 July 2014; doi: 10.1038/cr.2014.87
2、 Xuebing Wu, David A Scott, Andrea J Kriz, Anthony C Chiu, Patrick D Hsu et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nature Biotechnology (2014) DOI: doi:10.1038/nbt.2889.
3、 Cem Kuscu, Sevki Arslan, Ritambhara Singh, Jeremy Thorpe & Mazhar Adli. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nature Biotechnology (2014) DOI: doi:10.1038/nbt.2916