CRISPR新品巡礼：Life Tech[新品推荐]

近年来，基因组编辑技术风生水起，而CRISPR技术更是掀起了基因组编辑的热潮。短短一年间，CRISPR技术已登上了数个知名榜单，包括Science的十大科学突破，Nature Methods的值得关注技术，以及Technology Review的十大突破技术。利用CRISPR技术发表的文章更是层出不穷。

CRISPR/Cas系统为何如此受欢迎？因为它快速简单、价格低廉，且非常高效。通过这一系统，研究人员能够轻松地实现基因组编辑。此系统包含两个组分，核酸内切酶Cas9和非编码向导RNA（gRNA）。gRNA又由两部分组成：与目标互补的CRISPR RNA（crRNA）和辅助性的反式激活crRNA（tracrRNA）。

gRNA指导Cas9核酸酶到达特异的基因组位点，而Cas9蛋白在目标序列上引入双链DNA断裂（DSB）。在CRISPR/Cas9诱导的DNA断裂后，DSB可通过细胞修复机制来修复，非同源末端连接（NHEJ）或同源性指导的修复机制。这一切看上去并不复杂，但若是自己动手设计，恐怕也不轻松吧。好在，市场上一些公司已经推出了商业化的CRISPR/Cas载体，将这些必要的元件组合成单个载体，简化了实验设计。

All-in-one载体系统

Life Technologies的GeneArt® CRISPR核酸酶载体试剂盒（GeneArt® CRISPR Nuclease Vector Kit）就是这样一个all-in-one的系统。这个表达载体包含了Cas9核酸酶表达框和gRNA克隆框，能够轻松地克隆编码目标特异性crRNA的双链DNA。这样，只需单个质粒，就能以序列特异的方式编辑和改造基因组位点。

目前，Life Tech提供两种形式的载体，分别带有橙色荧光蛋白（OFP）和CD4，适用于目标细胞群的分选和富集。对于带OFP的GeneArt® CRISPR核酸酶载体，Cas9通过一个自我切割的2A肽键与OFP融合，从而实现了Cas9和OFP从同一mRNA上表达。这样，我们就能够通过荧光追踪转染效率，并实现目标细胞群的流式分选。

若是希望通过磁珠来分选目标细胞群，则可以选择带有CD4的GeneArt® CRISPR核酸酶载体。同样，Csa9也是通过一个自我切割的2A肽键与CD4融合的。对于表达Cas9和gRNA的细胞，我们可以利用Dynabeads CD4磁珠进行富集。转染效率则可利用CD4荧光抗体来评估。

实验流程

1. 设计

基因组编辑的第一步是设计出两条单链的DNA寡核苷酸（24-25 bp），一条编码目标特异的crRNA（正向链），另一条与之互补（反向链）。基因组目标序列的选择会显著影响切割效率。因此，我们建议您检测不止一条crRNA序列。Life Tech提供了一些设计指南，供你参考。目前一些网页工具，如MIT的CRISPR Design（crispr.mit.edu），也能帮你的忙。

• 长度：选择一段长度在19-20个核苷酸的目标序列，它邻近目标序列3’端的PAM序列。
• 同源：确保目标序列不包含与其他基因的明显同源，因为这会增加脱靶作用。
• 方向：你可以选择编码正义链或反义链的目标序列，只要它满足PAM的要求。

2. 克隆和转化

首先是将编码crRNA的DNA寡核苷酸退火，之后是利用T4 DNA连接酶将双链寡核苷酸克隆到线性化的Cas9核酸酶报告载体中。接着就是将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，并筛选理想的CRISPR克隆。这个过程就不赘述了，大家都是高手。

3. 转染

CRISPR质粒大于9 kb，因此不太容易转染。Life Tech建议使用脂质体转染试剂，如Lipofectamine 3000，来改善转染，从而提高切割和重组的效率。不过，即使用了高效转染试剂，转染还是少不了优化。具体的优化过程，详见《Life Tech带你优化基因组编辑》。

4. 检验

切割效率可采用GeneArt® 基因组切割检测分析（GeneArt® Genomic Cleavage Detection Assay）进行检测，这一技术采用错配检测内切酶来检测细胞内NHEJ修复期间因合并插入和/或切除而产生的插入或缺失。

或者，你也可以采用NGS或Sanger测序来测定CRISPR/Cas9系统所诱发的插入缺失。若转染或切割效率很低，则需要先富集表达Cas9和gRNA的细胞。

5. 富集

之前我们提到过，在表达载体上Cas9与OFP或CD4相连，因此可利用荧光显微镜或FACS来监控转染效率。此外，通过流式或磁珠分选，我们也可以富集表达Cas9和gRNA的细胞。Life Tech发现，Cas9-OFP或Cas9-CD4表达量最高的细胞也表现出最高的基因组DNA切割效率。因此，他们建议利用FACS富集时，分选弱、中等和亮的细胞群，这分别对应了低、中等和高表达的细胞。

虽说万事开头难，但有了这一整套的产品，相信开展基因组编辑并不是很困难的事情。不过，要将其应用在哪一方面，就看你的了。（生物通 余亮）

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