蛋白质印迹手册15：半干转操作详解[创新技巧]

下列操作介绍了利用半干转印系统将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）转移到Immobilon® PVDF转印膜的标准步骤。它适合以阳极板作为底座的半干转印装置。对于以阴极板作为底座的装置，请参考使用说明书，了解建议的缓冲液和转印堆积层。本操作介绍了一种三缓冲液的系统。单缓冲液也可使用。请咨询制造商。

提示：对于半干转印系统，滤纸和膜必须切成与凝胶同样大小，这样电流才被迫穿过凝胶。
提示：在两种类型的转印系统（槽和半干）中，必须格外小心，以避免在滤纸、凝胶和膜之间引入气泡。
建议 – 在恒定电流下转印蛋白质。如果在恒定电压下转印，监控电流，使其不超过0.4 amp。从100 V开始，如果电流过高，则降低电压。
提示：Immobilon® 转印膜的两侧同样有效。任一侧的外观（有光泽或无光泽）对转印和膜的检测效率没有影响。
提示：对于包含小肽的样品，凝胶在转印缓冲液中的平衡应限制在10分钟以内。
凝胶可单独转移，也可多块凝胶在单个堆积层中转移。

必需的设备和溶液

对于单个转移：
• 包含已分辨蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶。
• Immobilon® PVDF转印膜，切成与凝胶相同的大小（带有缺角）。
• 六张Whatman® 3MM滤纸或类似产品，切成与凝胶相同的大小。
• 半干转印系统，能容纳凝胶。
• 阳极缓冲液I：0.3 M Tris，pH 10.4，10%（v/v）甲醇
• 阳极缓冲液II：25 mM Tris，pH 10.4，10%（v/v）甲醇
• 阴极缓冲液：25 mM Tris和40 mM 6-氨基己酸（甘氨酸可替代），10%（v/v）甲醇，pH 9.4
• 甲醇，100%
• Milli-Q® 水

对于多个转移，以上全部再加上：
• 透析膜，切成与凝胶相同的大小，并用Milli-Q® 水润湿。（膜的分子量排阻应足够小，以保留凝胶中分子量最小的蛋白质）。
• 更多滤纸。

准备

1. 准备200 mL每种阳极缓冲液和400 mL阴极缓冲液。
2. 从转印夹中取出凝胶；切掉积层胶和点样孔。
3. 将凝胶浸泡在200 mL阴极缓冲液中15分钟。
4. 将两张滤纸浸泡在阳极缓冲液I中至少30秒。
5. 将一张滤纸浸泡在阳极缓冲液II中至少30秒。
6. 将三张滤纸浸泡在阴极缓冲液中至少30秒。
7. 准备转印膜：
a. 将膜在甲醇中浸泡15秒。膜应均匀地从不透明变成半透明。
b. 小心将膜放入Milli-Q® 水中，浸泡2分钟。
c. 小心将膜放入阳极缓冲液II中，至少平衡5分钟。

转印堆积层

对于所使用的半干转印系统，请参考制造商的具体操作说明。切记：为了确保均匀的转移，请在堆积层中每一层的表面小心滚动移液管或搅拌棒，以去除气泡。不要施加过大的压力，以防止损坏膜和凝胶。

对于单个转移：
1. 将阳极电极板放在水平台面上。
2. 将两张浸泡过阳极缓冲液I的滤纸放在电极板中央。
3. 将一张浸泡过阳极缓冲液II的滤纸放在前两张上面。
4. 将膜放在滤纸上面。
5. 将凝胶放在膜上面。
6. 将三张浸泡过阴极缓冲液的滤纸放在凝胶上面。
7. 将阴极电极板放在堆积层的最上面。

对于多个转移：
1. 将阳极电极板放在水平台面上。
2. 将两张浸泡过阳极缓冲液I的滤纸放在电极板中央。
3. 将一张浸泡过阳极缓冲液II的滤纸放在前两张上面。
4. 将膜放在滤纸上面。
5. 将凝胶放在膜上面。对于最后一块凝胶，请转到第10步。
6. 将一张浸泡过阴极缓冲液的滤纸放在凝胶上面。
7. 将一张透析膜放在滤纸上面。
8. 将一张浸泡过阳极缓冲液II的滤纸放在透析膜上面。
9. 重复第4-8步，直到所有凝胶（直到凝胶的最大数量）都放入堆积层中。
10. 将三张浸泡过阴极缓冲液的滤纸放在膜上面。
11. 将阴极电极板放在堆积层的最上面。
切记：在运行过程中切勿碰撞阴极板盖，因为这会扰乱转印堆积层的对齐，使结果不准确。

蛋白质转印

1. 将黑色阴极引线（-）插入阴极板插孔。
2. 将红色阳极引线（+）插入阳极板插孔。
3. 将阴极引线和阳极引线连接到相应的功率输出。
4. 打开电源开关。
5. 设定电流，按下表中显示的时间运行：

电流密度	时间限制
0.8 mA/cm2*	1-2小时
1.2 mA/cm2	1小时
2.5 mA/cm2	30-45分钟
4.0 mA/cm2	10-30分钟

* 表面积（cm2）是根据阳极板上堆积层的尺寸计算的。此数值与堆积层中的凝胶数量无关。
6. 在转印完成后，关闭电源。
7. 断开系统的引线。
8. 取下盖子。
9. 取出并丢弃滤纸。
注意：在使用石墨板时，阳极电极板上的石墨颗粒偶尔会出现在滤纸上。这些颗粒不会影响操作。
10. 取出凝胶。
11. 用镊子取出转印膜。

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