专访：第二军医大学新发现促肝脏再生

　　

   肝脏是人体最大的内脏器官，时下许多养生节目对于脂肪肝，肝硬化等等都进行了详细的介绍，从中这一器官的重要性可见一斑。肝细胞移植被认为是治疗肝衰竭的最佳方法之一，但是目前移植肝细胞在宿主肝脏内增殖缓慢，造成了这一治疗手段的重要阻碍，为此不少基础研究和临床研究的科学家们耗尽心力，希望能解决这一问题。

   近期来自第二军医大学基础部细胞生物学教研室，内蒙古大学哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室等处的研究人员探讨了一种重要的细胞周期调节因子：FoxM1在增强肝细胞增殖能力，促进肝脏再殖方面的关键作用，并构建了一种传递FoxM1基因的非病毒载体，这避免了病毒载体所带来的内源性病毒重组、插入激活和免疫反应强等不安全因素，将有助于人体肝脏疾病的细胞治疗。

   这一研究成果公布在Nature出版社旗下Cell Death & Disease杂志上，文章的共同通讯作者为第二军医大学基础部细胞生物学教研室胡以平教授、何志颖副教授以及内蒙古大学哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室王欣教授。胡以平博士目前的研究方向是肝肝细胞的生物医学问题研究。何志颖博士主要从事肝向重编程、干细胞的肝向分化及肝脏疾病的细胞和基因治疗等研究。第一作者分别为向导(第二军医大学，现单位海军医学研究所)，刘长城(第二军医大学)，王敏君(第二军医大学)。为了更深入的了解这一研究成果，生物通特联系了向导，就读者感兴趣的问题请教了他。

肝细胞移植与FoxM1因子

   肝脏承担着数百种功能，包括产生蛋白质与凝血因子，以及促进消化与能量释放等。肝功能衰竭是由于肝细胞受到广泛严重的损害，机体代谢功能发生严重紊乱而出现的临床综合征。肝衰竭发生于许多严重的肝脏疾病过程中，症候险恶，预后多不良。

   在近几十年里，肝细胞移植已经发展成为了替代肝脏移植，治疗晚期肝脏疾病的方法，虽然研究已证明移植的肝细胞能进入受体肝脏，并且数量可以达到原有肝脏的2%，但是目前还不清楚这种方法对于移植具有哪些具体的临床益处，而且移植肝细胞在宿主肝脏内增殖缓慢，也是阻碍肝细胞移植治疗的一大屏障。

   Forkhead box M1 (FoxM1)蛋白是一种转录因子，在调节细胞周期方面发挥了重要作用。之前的研究曾表明，当把FoxM1从小鼠中去除后，幼鼠在出生后不久就因心脏衰竭而死亡，此外研究还显示FoxM1因子表达失调会造成异常的细胞增殖，导致引发癌症。而且这种作用因子也是肝祖细胞有丝分裂，以及肝内胆管和血管发育过程中的必需元素。

FoxM1与肝脏再殖能力

   为了探讨活体内持续表达FoxM1的肝细胞是否可以增强再殖肝脏的能力，在这篇文章中，研究人员首先采用TTR-FoxM1转基因小鼠模型，获得FoxM1持续表达的肝细胞开展肝脏再殖能力的评价。将相同数量的TTR-FoxM1肝细胞和野生型肝细胞分别移植或通过竞争性实验混合移植进入检验肝脏再殖的理想模型——FAH基因剔除小鼠（Fah^-/-小鼠），分别在不同时间点分析两种细胞肝脏再殖的效率。

   “我们发现FoxM1持续表达的TTR-FoxM1肝细胞在相同时间点完成的再殖程度更高，再殖损伤肝脏的能力比野生型肝细胞提高了1.5倍，并且比野生型肝细胞提前2周完成完全的肝脏再殖。

   同时，我们将相同数量的TTR-FoxM1肝细胞和野生型肝细胞移植到2/3肝切的小鼠模型中，在急性肝损伤模型中评价肝脏再殖能力。结果显示，表达FoxM1的TTR-FoxM1肝细胞的肝脏再殖效率为5%~9%，而对照野生型肝细胞的再殖效率不超过1%。这些结果表明，活体内FoxM1过表达的肝细胞具有更强的生长和生存优势”，向导说。

高表达FoxM1的技术策略：非病毒载体

   既然FoxM1的高表达可以提高肝细胞在活体内再殖肝脏能力，那么下一步当然是探讨如何令肝细胞FoxM1高表达。通过DNA运载系统载体改造野生型肝细胞，从而获得FoxM1持续表达的肝细胞，这是未来开展临床应用的必经途径。

   第二军医大学的研究人员引入了能整合基因组并能长期稳定表达的非病毒载体——Sleeping Beauty（SB）转座子系统，并构建了FoxM1 SB载体。

   “在前期工作中，基于Fah-/-小鼠的肝脏再殖特性，我们建立了应用SB载体同时将多个基因导入肝实质细胞的技术体系。我们采用液体压力法将FoxM1 SB载体经尾静脉注射Fah^-/-小鼠，对注射后获得的FoxM1稳定表达的肝细胞进行增殖能力和肝脏再殖能力分析，评价SB转座子系统传递FoxM1基因修饰肝细胞的有效性及稳定表达FoxM1肝细胞的增殖能力。与野生型肝细胞相比，在相同时间内SB-FoxM1稳定表达的肝细胞肝脏再殖程度更高，这一结果与TTR-FoxM1转基因小鼠模型的结果相似。

    通过活体生物荧光成像技术，我们证明了SB-FoxM1稳定表达的肝细胞比对照组野生型肝细胞提前2周完成完全的肝脏再殖。同样的，将SB-FoxM1稳定表达的肝细胞移植到2/3肝切小鼠模型中，实现了4%~9%（最高15%）的肝脏再殖。在体外实验中，体外培养的SB-FoxM1肝细胞比野生型肝细胞具有更高BrdU掺入阳性细胞比例，表明其具有增强的增殖活性。以上实验结果表明，应用SB载体可有效地传递FoxM1基因，稳定表达FoxM1的肝细胞具有增强的增殖能力，在慢性和急性肝损伤模型小鼠中再殖损伤肝脏的能力都较野生型肝细胞有显著地提升。这些结果表明，通过载体质粒运载直接转染赋予活体内肝细胞FoxM1稳定表达的一种方式”，向导说。

   与此同时，研究人员还通过直接体外转染新鲜分离的肝细胞，也获得了表达FoxM1的肝细胞，并对其进行再殖能力的检测与分析。并且他们通过再殖实验，证明了这种修饰后的肝细胞也同样具有更强的肝脏再殖能力。这一结果表明，高表达FoxM1的外源性肝细胞也同样可以作为提高再殖肝脏能力的一种方式。

关键小鼠模型

   在这项研究中，小鼠模型起到了重要作用，首先是延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)基因敲除小鼠模型。这是一型遗传性高酪氨酸血症的小鼠模型。在酪氨酸代谢过程中，会生成对肝肾有毒性的中间产物，然后由fah酶催化分解为无毒的延胡索酸和乙酰乙酸。而一型遗传性高酪氨酸血症的病人这种酶缺失，导致毒性中间产物不能分解而累积，从而造成肝肾损伤，甚至致死。而通过服用代谢过程的阻断剂NTBC可以阻止其发生，酪氨酸转由其它途径代谢。

   “这种模型小鼠在饲喂NTBC时其表型与WT小鼠相似。这种小鼠模型是一种很好的肝细胞移植受体，通过移植小鼠肝细胞同时停药，受体自身的肝细胞损伤，促进移植细胞的增殖从而达成肝脏再殖，通过FAH的免疫组化染色可以很方便地检测出外源细胞的再殖程度”，向导说。

   另外一种是TTR-FoxM1转基因小鼠：在其肝细胞中由肝脏组成性表达的肝甲状腺素结合蛋白（TTR）启动子启动调控FoxM1表达，因此FoxM1在这种模型小鼠的肝脏中组成性地持续高表达。

考究应用安全性问题

   之前的研究表明，上调细胞周期因子有可能会引起组织的异常增生，甚至诱发肿瘤，这是必须考虑的安全性问题。

   “我们通过病理学检查发现，持续表达FoxM1细胞移植后重建的受体肝脏形态结构正常。而且通过贯序移植及在体长时间观测实验都没有发现肿瘤的发生，通过激光捕获显微切割技术获取FoxM1表达肝细胞移植后重建的受体肝脏组织，进一步检测肿瘤相关基因表达，也发现FoxM1在肝细胞中的过表达不会诱发肿瘤的发生。这些证据表明，FoxM1可以安全的应用于增强肝细胞增殖能力的研究中，”向导说。

   从总体上来说，这项研究证明了细胞周期调节因子FoxM1具有增强肝细胞增殖能力和促进肝脏再殖的作用。在该研究中所建立的非病毒载体传递FoxM1基因的技术体系，避免了病毒载体所带来的内源性病毒重组、插入激活和免疫反应强等不安全因素，这在一定程度上增加了该体系在人类肝脏疾病细胞治疗中的实用性。而且，证明了通过遗传修饰的肝细胞中，其FoxM1的高表达不会诱发肿瘤。这一研究的开展，为解决移植肝细胞在宿主肝脏内增殖缓慢的问题提供了一个新的思路。

原文摘要：
Non-viral FoxM1 gene delivery to hepatocytes enhances liver repopulation

Hepatocyte transplantation as a substitute strategy of orthotopic liver transplantation is being studied for treating end-stage liver diseases. Several technical hurdles must be overcome in order to achieve the therapeutic liver repopulation, such as the problem of insufficient expansion of the transplanted hepatocytes in recipient livers. In this study, we analyzed the application of FoxM1, a cell-cycle regulator, to enhance the proliferation capacity of hepatocytes. The non-viral sleeping beauty (SB) transposon vector carrying FoxM1 gene was constructed for delivering FoxM1 into the hepatocytes. The proliferation capacities of hepatocytes with FoxM1 expression were examined both in vivo and in vitro. Results indicated that the hepatocytes with FoxM1 expression had a higher proliferation rate than wild-type (WT) hepatocytes in vitro. In comparison with WT hepatocytes, the hepatocytes with FoxM1 expression had an enhanced level of liver repopulation in the recipient livers at both sub-acute injury (fumaryl acetoacetate hydrolase (Fah)–/– mice model) and acute injury (2/3 partial hepatectomy mice model). Importantly, there was no increased risk of tumorigenicity with FoxM1 expression in recipients even after serial transplantation. In conclusion, expression of FoxM1 in hepatocytes enhanced the capacity of liver repopulation without inducing tumorigenesis. FoxM1 gene delivered by non-viral SB vector into hepatocytes may be a viable approach to promote therapeutic repopulation after hepatocyte transplantation.

第二军医大学基础部细胞生物学教研室简介

第二军医大学基础部细胞生物学教研室成立于1998年，其前身是1950年成立的生物学教研室。该教研室为我校国家重点学科——遗传学科、国家“211工程”生物学学科群的建设单位，是细胞生物学专业的硕士学位和博士学位授权点及博士后流动站。现任第二军医大学干细胞与医学研究中心主任、转基因动物研究室主任胡以平教授为学科带头人。