《NEJM》：新一代测序技术挽救危重病男孩

一个14岁男孩患上一种神秘的脑炎，这种疾病使他入院六周，并一度陷入药物引起的昏迷状态。但是，通过新一代的DNA分析工具，他的病情突然好转并快速恢复。相关研究结果发表在2014年6月4日的《新英格兰医学杂志》（New England Journal of Medicine）。

　　

生物通报道：一个14岁男孩患上一种神秘的脑炎，这种疾病使他入院六周，并一度陷入药物引起的昏迷状态。但是，通过新一代的DNA分析工具，他的病情突然好转并快速恢复，这表明，即使医生没有嫌疑对象时，也可以用新的DNA分析工具来揭示危及生命感染的原因。

根据加州大学旧金山分校（UCSF）医学实验室的华裔教授Charles Chiu介绍，在对脑脊髓液和血液进行分析仅仅48小时后，该男孩就得到了快速的诊断和成功治疗，这预示着强大的“下一代测序（NGS）”技术在解开传染病谜团中的更广泛应用，不仅可用于前沿的研究机构，而且可用于随处可见的、医生可以接近的临床实验室。相关研究结果发表在2014年6月4日的《新英格兰医学杂志》（New England Journal of Medicine），Chiu是这项案例研究的资深作者。

Chiu实验室开发的工作流程，极大简化了疾病病原体的遗传检测，用NGS技术大大缩短了样品采集和可行诊断之间所需的时间，帮助威斯康星大学的一个医疗小组挽救了年轻患者的生命。

这项NEJM研究，将更快DNA测序、日益增长的基因组数据库（用于识别病原体和其他生物体）和更先进的计算分析工具（快速分析数百万个数据点）融合起来。这个流程能够使研究人快速测序，同时识别患者样本中的所有DNA，而无需培养或靶定特定的传染病原体。

Chiu指出：“从成本和周转时间的角度来看，这是一项非常强大的技术，已成为切实可用的临床实验室常规实施技术。”目前，一些临床实验室可提供NGS检测，以确定临床试验中的癌症突变，并确定出生缺陷相关的突变，但直到现在，NGS一直被视为过于缓慢和费力，因此对常规的传染病诊断不太有用。

本文共同作者、UCSF生物化学和生物物理学主席、霍华德休斯医学院（HHMI）研究人员Joseph DeRisi，是使用新基因组技术来识别以前未知的病原体（如SARS冠状病毒）的领先者，他指出，现在用一个单项检测，花费几千美元的成本，基本上就能检测到任何病原体。

DeRisi首先接触的是男孩的医生——威斯康星大学麦迪逊分校医学和公共健康学院的儿科和医学教授James Gern博士以及一项较早研究的合作者。然后，他邀请UCSF其他科学家致力于NGS技术，包括Chiu和DeRisi实验室的一个成员Michael Wilson博士（神经学助理教授，该研究的第一作者）。

最初几周，在威斯康星大学经过昂贵的检测和程序，并没有发现疾病的原因，在USCF实验室应用强大的NGS流程，最终带来了明确无误的诊断。

微生物感染的早期检测没有发现任何线索。相反，男孩的临床实验结果和病史——他出生时具有严重联合免疫缺陷病（SCID），似乎表明更可能是一个免疫反应引发了他的疾病。威斯康星大学的医生给他施用了糖皮质激素——通常用于自身免疫性脑炎的一种有效疗法，但是男孩的病情却恶化了。他出现了严重的脑积液和无法控制的癫痫发作，只在药物引起的昏迷后才平息下来。

同时，在USCF，Wilson和Chiu实验室合作，从患者的脑脊液和血液样本及一个对照样本中，产生了1000万个不同的DNA序列。医学研究人员使用Illumina的MiSeq DNA测序仪——最近被美国食品和药品管理局批准用于临床诊断实验室，经过一个通宵就完成了测序。

Chiu研究小组开发了一种分析工具，称为SURPI，同时发表在《Genome Research》的文章描述了这种工具，可让科学家们能够更迅速地将来自患者样本的DNA，与美国国家生物技术信息中心维护的GenBank进行比对。他们发现，来自患者脑脊液的300万个DNA序列中，有475个不同的DNA序列是来自一种称为钩端螺旋体（Leptospira）的细菌。虽然在脑脊液中检测到了钩端螺旋体，但并没有证据显示，在患者血液和阴性控制样本中也存在钩端螺旋体DNA。

Chiu说，这项DNA序列分析只需要96分钟。以前，利用相同硬件平台上的计算机软件进行的类似分析，将需要24小时或更多的时间。

更具体地说，研究人员确定，男孩已经感染了钩端螺旋体属的细菌（Leptospira santarosai），这种细菌原产于加勒比海和更温暖的地方。威斯康星和UCSF的医生建议，用低风险的抗生素治疗——青霉素，医疗小组决定不用临床批准的试验确诊而进行治疗。治疗消除了感染，在治疗开始三周后，患者被允许从ICU病房出来。在入院后第76天，经过住院康复治疗，他能够出院返回家中。

在治疗开始后，没有标准的临床试验可以立即进行确诊。在治疗5个月后，美国疾病控制和预防中心的工作人员，通过修改他们用于钩端螺旋体的标准测试，最终确证了UCSF的诊断。

在美国，大约有2万人（主要是儿童），每年因脑肿胀脑炎入院，有4000多人因脑膜炎入院。在几乎一半的脑炎病例中，并没有发现病因，然而，这项NEJM案例指出，如果不能将传染与自身免疫区分开来，可能会引起更严重的病情。

回想起来，这个男孩在入院一年以前，曾随家庭呆在波多黎各，可能在这期间他遇到了细菌。在那之后，他仅经历了间歇性的头痛、发烧和其他症状。这些症状虽然可以初步得到改善，但是最终他的病情更加严重，在发现钩端螺旋体之前，他在四个月内曾三次入院。

根据Chiu介绍，然而目前还没有监管机构批准将NGS检测传染疾病用于商业临床检验室的常规诊断。NEJM案例中使用的实验诊断程序，是在临床实验室中，根据所有规范实验室共用的标准操作流程进行的。他希望在几个月内获得批准，能够在UCSF临床微生物实验室，为某些类型的传染病，提供一种NGS诊断检测。

（生物通：王英）

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生物通推荐原文摘要：
Actionable Diagnosis of Neuroleptospirosis by Next-Generation Sequencing
Abstract: A 14-year-old boy with severe combined immunodeficiency presented three times to a medical facility over a period of 4 months with fever and headache that progressed to hydrocephalus and status epilepticus necessitating a medically induced coma. Diagnostic workup including brain biopsy was unrevealing. Unbiased next-generation sequencing of the cerebrospinal fluid identified 475 of 3,063,784 sequence reads (0.016%) corresponding to leptospira infection. Clinical assays for leptospirosis were negative. Targeted antimicrobial agents were administered, and the patient was discharged home 32 days later with a status close to his premorbid condition. Polymerase-chain-reaction (PCR) and serologic testing at the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) subsequently confirmed evidence of Leptospira santarosai infection.