如何让你的克隆天衣无缝

【字体: 时间:2014年06月24日 来源:生物通

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  DNA克隆带来的那场分子生物学革命已经过去了四十多年。在这段时间里,DNA的克隆工具并没有发生多大的变化,对于许多研究者而言,DNA克隆仍然意味着限制性酶切消化和DNA连接。

生物通报道:DNA克隆带来的那场分子生物学革命已经过去了四十多年。在这段时间里,DNA的克隆工具并没有发生多大的变化,对于许多研究者而言,DNA克隆仍然意味着限制性酶切消化和DNA连接。

不过据Thermo Fisher产品开发经理Lisa Stillwell介绍,这种传统方法也存在着一些明显的局限。首先,关键的酶切位点可能出现在需要组装的序列中,需要更加复杂的克隆方案。

而且一般的限制性内切酶,并不适合组装两个以上的片段。就算只组装两个片段也是很麻烦的,在消化和连接之间还需要进行多个步骤,比如去磷酸化和回收纯化。

此外,传统的限制性内切酶克隆技术,会在两个片段的结合位置上形成一道“疤”或“缝”,这种瑕疵可能会对DNA片段的行为产生微妙的影响。这一点特别令合成生物学家头疼,因为他们常常要将启动子和终止子这样的DNA片段转变为可预测的独立元件。(推荐阅读:Nature新闻:发布基因工程标准化元件

于是,基于合成生物学领域的旺盛需求,“无缝”克隆技术横空出世。

Gibson组装

Gibson Assembly®J. Craig Vente研究所的Daniel Gibson开发,是最常用的新兴克隆方案之一。这一技术被用来构建了第一个人造细胞(Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.)的基因组。Gibson组装是一种简单的等温一步拼接法,只需要一种master mix(含有三种酶)和大约一小时的孵育。

Gibson组装之前,需要对待克隆的DNA片段(包括载体)进行PCR扩增,添加15 bp30 bp的短重叠序列。这些序列可以保证DNA片段按正确的顺序进行拼接。然后就可以将这些片段直接添入到50℃的克隆反应,DNA外切酶先从5’端降解核苷酸产生粘性末端,然后相邻片段之间的重叠序列退火,最后DNA聚合酶和DNA连接酶将序列填充,形成完整的双链DNA分子,实现无痕拼接。

NEB公司负责Gibson克隆产品的产品经理Cathy Shea指出,这一反应经过优化已经可以用来拼接六个片段,能拼接最小约120bp的片段,也能拼接12kb的片段。SGI-DNAJustin Bingham介绍,Gibson组装可以拼接超过80kb的片段,SGI-DNA属于Synthetic Genomics公司,专门为用户提供DNA合成服务。

Gibson拼接的优势在于它非常快,”Shea说。Gibson组装能直接使用PCR片段,不需要回收步骤,而且可以处理多个片段。但Gibson组装也有缺陷,这一过程没有生成限制性位点,因此把拼接片段转移到另一个载体并不很容易。Shea建议,如果你之后需要转移克隆的片段,那最好事先设计好限制性位点。

NEB公司提供有在线设计工具NEBuilder™,可以帮助你进行Gibson组装的实验设计。

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GeneArt无缝克隆与组装

Life Technologies公司的GeneArt® Seamless Cloning and Assembly试剂盒也是一个常用的拼接工具。首先,要将含有重叠序列的DNA片段与载体一同添入组装循环,进行外切酶消化、退火和填充。随后将组装的序列转入细胞,通过同源重组闭合DNA环。

Stillwell还介绍了GeneArt® Seamless PLUS Cloning and Assembly试剂盒,该产品能在一个30分钟的室温反应中,组装总共40kb的五个DNA片段(四个插入片段和一个载体片段),最后的连接步骤在E. coli中完成。GeneArt t® High-Order Genetic Assembly System能够在酿酒酵母(S. cerevisiae中组装高达110kb10个片段,但这一过程需要三天时间。

Life Technologies公司也为用户提供了专门的设计工具——GeneArt® Primer and Construct

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Type IIs克隆

Type IIs克隆依赖于IIs型限制性内切酶,也被称为Golden Gate克隆


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