蛋白质印迹手册11：影响免疫检测的因素（上）

【字体：大中小】 时间：2014年06月23日 来源：默克密理博

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　　影响免疫检测的因素有很多，包括缓冲液、封闭、抗体、清洗、检测底物等等。了解下列章节中提出的有关免疫检测的概念，将有助于优化特定样品的操作。

了解下列章节中提出的有关免疫检测的概念，将有助于优化特定样品的操作。

缓冲液

最常用的两种缓冲液是磷酸盐缓冲液（PBS）和Tris缓冲液（TBS）。调整配方中缓冲液组分的各种改良配方已见诸期刊。缓冲液的关键要求是它应有助于保持抗体的生物活性。因此，离子强度和pH值应相当接近生理状态。PBS的配方（磷酸盐总浓度10 mM）适用于广泛的抗体和检测底物。

在孵育过程中，装有膜的容器应轻轻摇动。缓冲液的量应足够，完全覆盖膜，使其在缓冲液中自由漂浮。如果不止一张印迹放在容器中，缓冲液容量不足会导致印迹膜粘在一起。这将影响孵育溶液的充分接触，导致各种假象，如背景高、信号弱和灵敏度不均匀等。

封闭

要获得有意义的结果，必须保证抗体只与感兴趣的蛋白质结合，而不与膜结合。利用惰性蛋白、非离子去污剂，或无蛋白的封闭剂（如Bløk® noise-canceling试剂）来封闭膜上未被占据的位点，可减少抗体的非特异结合（NSB）。封闭剂与膜的亲和力应高于抗体。它应填满膜上未被占据的位点，但不会替换膜上的目标蛋白。最常用的封闭剂是牛血清白蛋白（BSA，0.2-5.0%）、脱脂牛奶、酪蛋白、明胶、吐温20去污剂的稀释液（0.05-0.1%）以及Bløk®试剂。研究表明，吐温20去污剂对抗原有复性的作用，从而能够提高特异抗体对抗原的识别（Van Dam等，1990；Zampieri等，2000）。其他去污剂，如Triton® X-100去污剂、SDS和NP-40，有时也会使用，但可能会太过剧烈而破坏了蛋白之间的相互作用。封闭剂通常溶解在PBS或TBS中。

与封闭相关的风险包括：选择不适当的封闭剂或过量封闭会替换或掩盖目标蛋白质。因此，封闭剂的正确选择对成功的免疫检测很关键。例如，奶粉不能用于生物素化或刀豆蛋白标记的抗体，因为牛奶中含有糖蛋白和生物素。在用磷酸化特异性抗体对磷酸化蛋白进行检测分析时，如果采用粗蛋白制剂作为封闭剂，由于这些制剂中可能含有磷酸酶，而印迹上的磷酸化蛋白会被这些酶去磷酸化，就有可能会影响分析结果。研究表明，在封闭液中添加磷酸酶抑制剂可增强磷酸化特异性抗体的信号（Sharma和Carew，2002）。此外，适用于一种抗原-抗体组合的封闭剂可能不适用于其他组合。

封闭剂和检测试剂之间的兼容性可通过操作1.5（第41页）中介绍的斑点印迹方法来确定。封闭液被点样在空白的PVDF膜上，而膜已在甲醇中浸润，并在TBS中平衡。随后在印迹上添加检测试剂，孵育5分钟，并曝光在X射线胶片上。暗斑的出现则表明封闭剂与检测试剂不兼容（图19，第42页）。必须记住，与Immobilon®-P转印膜相比，Immobilon®-PSQ转印膜的表面积更高，孔径更小，可结合更多的蛋白质。如果在标准的Western印迹操作中用Immobilon®-P转印膜来替代Immobilon®-PSQ转印膜，那么封闭液可能不足以饱和膜表面。可能需要更多的清洗步骤来降低背景。利用斑点印迹方法，可方便地优化封闭（第40页）。

抗体

在封闭之后，印迹与一个或多个抗体孵育。第一个抗体与目标蛋白结合，而第二个抗体与第一个结合。第二个抗体结合有酶或染料，可用来指示蛋白的位置。

尽管一抗能直接标记，但使用二抗有明显的优势。首先，不止一个二抗分子能够与单个一抗分子结合，形成信号扩增。其次，标记的二抗（酶-抗体结合物）可用于大量不同特异性的一抗，从而不再需要标记多个一抗。

多克隆或单克隆的一抗都可使用。多克隆抗体通常是以抗血清或亲和纯化的抗体形式提供的。单克隆抗体是在腹水或组织培养液中表达的，可直接使用或进行亲和纯化。一定要记住，变性蛋白可能无法被天然抗原培育出的抗体所识别。在某些情况下，可能需要非变性凝胶来进行印迹。抗体以缓冲液和封闭液稀释，以避免与膜的非特异结合。抗体稀释液通常也包含痕量的吐温20或另一种去污剂，以防止抗体的非特异聚集。许多发表的化学发光操作需要在封闭液和抗体稀释液中添加0.1%（v/v）吐温20。我们必须认识到，高于0.05%（v/v）的浓度有可能从膜上洗掉一些印迹的蛋白质。

提高吐温20去污剂的浓度通常会降低背景。一种更简单且更经济的策略是降低抗体的浓度，特别是二抗（详见图12）。抗体必须特异针对目的蛋白，不能与封闭液中的组分交叉反应，且应该是相对纯净的。其他蛋白质或聚集物形式的杂质会导致非特异性结合和背景增高。

免疫检测是一种极其灵敏的方法。为了实现高的信噪比和最高的灵敏度，一抗和二抗的浓度应针对每种情况来优化。一般来说，高倍稀释一抗或降低凝胶上的蛋白上样量可减少非特异信号。高倍稀释酶标记的二抗可最大限度降低整体的高背景。

一抗和二抗的最佳浓度也取决于检测试剂的灵敏度。高灵敏度的试剂（检测到飞克级）与低灵敏度的试剂（检测到皮克级）相比，抗体用量可减少20倍。抗体浓度的优化取决于检测底物的例子如图13所示。在使用最灵敏的检测试剂（Luminata™ Forte试剂）时，过量的抗体导致高的非特异性和整体背景增高（左上）。在这种情况下，将一抗稀释度从1:1,000提高到1:10,000，改善了信噪比。在使用没那么灵敏的检测试剂（中间和最下面一行）时，抗体需要更为浓缩，以产生相同的信号。

图12. 二抗稀释度的优化，利用Immobilon® Western化学发光HRP底物对ERK1进行免疫检测。大鼠肝脏裂解液的两倍稀释物被上样到每块凝胶上。电转后的蛋白质与兔抗ERK1抗体（1:1,000稀释）以及HRP结合的山羊抗兔IgG（1:5,000、1:20,000和1:100,000稀释，从左到右）杂交。

图13. 检测试剂越灵敏，需要的抗体越少。包含指定量A431裂解液的免疫印迹与不同浓度的GAPDH抗体（货号 MAB374）杂交，如最上面一行，再与适当的二抗杂交。利用指定的Luminata™ HRP底物观察条带，并在X射线胶片上曝光5分钟。在这三种检测试剂中，Luminata™ Forte试剂最灵敏，Luminata™ Cresendo次之，最后是Luminata™ Classico试剂。

使用灵敏度较高的HRP底物，有三方面的优点：

1. 结果更佳：它产生更强的条带，带来更为定量的印迹（比较Luminata™ Cresendo和Forte底物在1:10,000稀释度下条带强度的增加）
2. 更快速：清洗印迹和添加新底物只需要10分钟，而重复抗体孵育需要2.5小时。
3. 更便宜：HRP底物比抗体要便宜得多。