挑出CpG甲基化位点的新策略

DNA甲基化是基因表达的一种有效的调节器。但是，如何决定一个目标位点的甲基化是否会影响转录，是具有挑战性的。最近，约翰霍普金斯大学的研究人员研制出一种新方法，可以阐明这个问题。相关研究结果发表在最近的《PLoS One》。

　　

生物通报道：DNA甲基化是基因表达的一种有效的调节器。DNA甲基化主要发生在富含CG的区域，所以称为CpG岛。如CpG岛位于某基因的启动子区域，CpG岛的甲基化会显著降低甚至完全沉默该基因的转录，继而影响蛋白的表达。但是，如何决定一个目标位点的甲基化是否会影响转录，是具有挑战性的。最近，约翰霍普金斯大学的研究人员研制出一种新方法，可以阐明这个问题。

CpG二核苷酸上的DNA甲基化，是真核生物中被充分研究过的一种表观遗传转录调控机制。通常，这种形式的甲基化涉及到多个位点，但是单个CpG位点的甲基化也会影响基因的表达。为了促进单一位点甲基化研究的发展，约翰霍普金斯大学的Marc Ostermeier和他以前的研究生Brian Chaikind，开发出一种新技术，可以选择优化的位点特异性DNA甲基转移酶，相关研究结果发表在最近的《PLoS One》。

Ostermeier的这种最新方法以其研究小组以前描述过的一种方法为基础，利用一种裂开的CpG甲基转移酶——M.SssI，与可识别目标CpG位点侧翼序列的锌指结构域（ZFD）熔合在一起。

Ostermeier解释说：“我们的想法是，分裂甲基转移酶，这样它就再也不能很有效地组装，然后你用DNA作为模板，在你想要甲基化的位点上，帮助组装甲基转移酶。因此，你增加了这两半甲基转移酶的局部浓度，可以化解它们没有组装好这一问题。然后，它们可以组装和甲基化那个位点。”

虽然Ostermeier的方法增加了期望CpG位点的甲基化，但仍然有明显脱离目标的CpG甲基化。因此，在最新的进展中，他和Chaikind转向努力降低非特异性DNA甲基化，同时保持目标位点甲基化。

新方法利用一个诱变的质粒文库，这些质粒包含N末端M.SssI片段/ZFD熔合的编码基因和C末端M.SssI片段/ZFD熔合的编码基因。C末端M.SssI片段，在5个选定的残基上携带随机变异，研究人员推测，这会减少其DNA的亲合力，而不影响催化活性。

利用位于甲基化敏感的FspI限制位点（两侧是锌指结合序列）的质粒中的目标CpG位点，研究人员选择来自FspI消化的甲基化依赖保护。然后，他们增加了创新的一步，利用与众不同的限制酶McrBC，针对非特异性的甲基化。McrBC可消化包含两个不同甲基化位点（而不仅仅是一个单一甲基化位点）的DNA，导致在目标CpG位点以外的一个或多个CpG位点甲基化的任何质粒DNA被消化。

FspI和McrBC消化后，核酸外切酶III消化会破坏任何裂开的质粒，留下编码高度特异性M.SssI片段/锌指熔合蛋白的完整质粒，用于另一轮的转换和选择。

从他们筛选中识别出的47个变体中，作者得到了一种优化的DNA甲基转移酶，能显著降低非特异性甲基化60倍，目标特异性甲基化降低很少，仅从94%降到了79%。

Chaikind和Ostermeier通过交换锌指结构域，继续显示他们系统的多功能性，这些结构域结合有人类细胞间黏附分子1（ICAM1）基因启动子区中的一个特异CpG位点的侧翼序列，表明该位点被甲基化，但是非目标位点却没有。

目前，该研究小组计划在真核细胞中靶定那个单一的ICAM1 CpG位点，以检测其位点特异性甲基化是否像其他研究显示的那样，会影响ICAM1的表达，也将验证这种位点特异性CpG甲基转移酶在真核生物研究中的效用。

（生物通：王英）

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生物通推荐原文摘要：
Directed evolution of improved zinc finger methyltransferases
Abstract: The ability to target DNA methylation toward a single, user-designated CpG site in vivo may have wide applicability for basic biological and biomedical research. A tool for targeting methylation toward single sites could be used to study the effects of individual methylation events on transcription, protein recruitment to DNA, and the dynamics of such epigenetic alterations. Although various tools for directing methylation to promoters exist, none offers the ability to localize methylation solely to a single CpG site. In our ongoing research to create such a tool, we have pursued a strategy employing artificially bifurcated DNA methyltransferases; each methyltransferase fragment is fused to zinc finger proteins with affinity for sequences flanking a targeted CpG site for methylation. We sought to improve the targeting of these enzymes by reducing the methyltransferase activity at non-targeted sites while maintaining high levels of activity at a targeted site. Here we demonstrate an in vitro directed evolution selection strategy to improve methyltransferase specificity and use it to optimize an engineered zinc finger methyltransferase derived from M.SssI. The unusual restriction enzyme McrBC is a key component of this strategy and is used to select against methyltransferases that methylate multiple sites on a plasmid. This strategy allowed us to quickly identify mutants with high levels of methylation at the target site (up to ~80%) and nearly unobservable levels of methylation at a off-target sites (<1%), as assessed in E. coli. We also demonstrate that replacing the zinc finger domains with new zinc fingers redirects the methylation to a new target CpG site flanked by the corresponding zinc finger binding sequences.