蛋白质印迹手册9：蛋白质观察

目前有许多类型的染料，包括有机染料（丽春红、氨基黑、固绿和考马斯亮蓝）、荧光染料（荧光胺、香豆素）以及胶体粒子（金、银、铜、铁和印度墨汁）（Kurien等，2003）。本文列出了在Western印迹中检测总蛋白的最常用染料。这些染料可分为两类：可逆和不可逆的染料。

透照

透照（图10）是一种PVDF膜特有的观察技术，首次介绍就是应用于Immobilon®-P转印膜上（Reig和Klein，1988）。这种技术利用PVDF膜特有的性质；被转印蛋白包被的PVDF区域能够在20%甲醇中浸湿，而PVDF的周围区域不行。PVDF湿润的区域逐渐变得光学透明，能够利用背光和照相存档来观察蛋白条带。此过程通过蒸发而完全可逆。因为蛋白质在转印过程中已暴露在甲醇中，所以蛋白质的进一步变性基本不会发生。尽管这种技术不能用于观察低丰度蛋白，但它能用来评估整体的转移效率以及印迹是否适合进一步分析。

染色

染色（图10）是一种让印迹上的蛋白质可见的简单技术。染色可用于：

• 验证蛋白质是否转移到膜上。
• 确定各泳道是否相同上样。
• 评估整体的转移效率，特别是对于新的缓冲液或蛋白质。
• 鉴定和切割条带用于肽段测序。

目前有许多类型的染料，包括有机染料（丽春红、氨基黑、固绿和考马斯亮蓝）、荧光染料（荧光胺、香豆素）以及胶体粒子（金、银、铜、铁和印度墨汁）（Kurien等，2003）。表5列出了在Western印迹中检测总蛋白的最常用染料。这些染料可分为两类：可逆和不可逆的染料。

可逆染料

可逆染料允许在评估印迹之后将其从膜上洗掉。这些操作不干扰后续的免疫检测或印迹上蛋白质的其他分析。最常用的蛋白可逆染料是丽春红。

可逆染料的主要缺点在于它们的灵敏度不及不可逆染料。由于印迹上高丰度蛋白的染色模式通常也能很好地指示了低丰度蛋白在多大程度上转移，这一缺点在大部分情况下被最小化。

荧光染料高度灵敏，且与下游的免疫检测、基于Edman的测序和质谱分析兼容（Berggren等，1999）。Sypro® Ruby和Sypro® Rose蛋白印迹染料（Life Technologies）可在显色、荧光或化学发光免疫染色步骤前使用，并可实现约1-2 ng/条带的检测灵敏度（Haugland，2002）。

不可逆染料

不可逆染料通常表现出最佳的灵敏度，但会干扰或阻止蛋白质的进一步分析。不可逆染料有氨基黑和考马斯亮蓝。

图10. 小牛肝脏蛋白在电转到Immobilon®-P转印膜后的观察：(A) 透照，(B) 考马斯亮蓝，(C) 丽春红，(D) 氨基黑和(E) CPTS总蛋白染料。从左到右，每条泳道依次是分子量标准品和12.2 μg、6.1 μg、3.1 μg裂解液。

表5. Western印迹中常用的染料及其性质。

	检测试剂 （每个斑点的蛋白质）	近似灵敏度	参考文献
可逆	丽春红	5 μg	Dunn等，1999
	固绿FC	5 μg	Dunn等，1999
	CPTS	1 μg	Bickar等，1992
	Sypro® Ruby	1-2 ng	Haugland，2002
	Sypro® Rose	1-2 ng	Haugland，2002
不可逆	氨基黑10B	1 μg	Dunn等，1999
	考马斯亮蓝R-250	500 ng	Dunn等，1999
	印度墨汁	100 ng	Dunn等，1999
	胶体金	4 ng	Dunn等，1999

（实际内容以《蛋白质印迹手册》印刷版为准，如有错漏，敬请谅解）

立即索取印刷版《蛋白质印迹手册》

上一篇          下一篇