Life Tech带你优化基因组编辑[创新技巧]

基因组编辑技术，如TALEN和CRISPR，实现了特定位点上DNA的靶向切割，为内源性修复机制打开了大门。不过这些工具的效果取决于转染效率、正确设计、特定位点的内在特征，以及鉴定和选择所用的下游过程。Life Technologies开发出一些产品，能够协助TALEN和CRISPR的设计和导入。同时，他们也提出了一些优化性能的策略。

基因组编辑技术，如转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）和规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR），实现了特定位点上DNA的靶向切割，为内源性修复机制打开了大门。不过这些工具的效果取决于转染效率、正确设计、特定位点的内在特征，以及鉴定和选择所用的下游过程。Life Technologies开发出一些产品，能够协助TALEN和CRISPR的设计和导入。同时，他们也提出了一些优化性能的策略。

设计时的考虑因素

TALEN

基因组编辑利用经过改造的核酸酶和内源性修复机制来改变细胞的DNA。TAL效应蛋白，如TALEN，包括恒定的N端和C端结构域（分别含有易位和核定位/激活信号），中间是重复结构域。每个重复片段的长度是34-35个氨基酸，其中位于中心的残基决定了重复片段与不同核苷酸靶点的亲和力。不同重复片段的组合和顺序决定了特定TAL效应蛋白的靶位点特异性。

这个TAL效应物“代码”的破译实现了蛋白质的改造，它们能靶定各种生物染色体上的开放区域，包括细菌、酵母、植物、昆虫、斑马鱼和哺乳动物。过去，由于重复结构域的退火问题，克隆和设计这些序列从技术上讲颇具挑战性。不过，现在有了更为简单的商业化选择。例如，Life Technologies提供了GeneArt网页设计工具，可设计、优化和构建定制的GeneArt Precision TALs。

您所选择的目标几乎是没有限制的。GeneArt Precision TAL效应物与DNA序列结合的可预测性使得它几乎能够靶定基因组中的任何序列。效应物结构域的选择随后决定了Precision TAL效应物是否能编辑、激活或抑制靶基因。

在您有了定制的酶之后，您可以利用GeneArt Genomic Cleavage Detection Assay来评估它的效率。此分析利用错配检测的核酸内切酶来检测非同源末端连接（NHEJ）修复过程中产生的插入和缺失（indel）。

CRISPR

基因编辑中所用的CRISPR-Cas系统是个原核的适应性免疫系统，它利用RNA导向的DNA核酸酶来沉默病毒的核酸。在细菌中，CRISPR的位点由一系列重复片段组成，它们由~30 bp的外源DNA片段隔开，这些片段被称为间隔序列（spacer）。这种重复序列-间隔序列的片段被转录成长的前体，并被加工成短的crRNA，它们指定目标序列，让Cas9核酸酶切割。

Life Technologies也开发出商业化的CRISPR-Cas系统。线性化的GeneArt CRISPR Nuclease载体提供快速、高效的向导RNA（gRNA）克隆，模拟了天然的crRNA- tracrRNA嵌合体。这个短的gRNA应当针对长度为19-20个核苷酸且邻近PAM（NGG）的目标序列而设计。必须注意，它不能与其他基因有明显的同源性。

由于gRNA提供了特异性，改变Cas9的目标只需要改变gRNA。当宿主的基因组DNA需要多个基因改变时，也可将多个gRNA克隆到一个载体上。

GeneArt CRISPR Nuclease Vector Kit实现了CRISPR-Cas系统中所有功能元件的表达和细胞群的富集。载体有两个报告基团可选：橙色荧光蛋白（OFP）适用于流式细胞分选，而CD4适用于基于磁珠的富集，它们都能够选择和富集表达Cas9和CRISPR RNA的细胞。

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如何高效转染

在你构建好了TALEN或CRISPR之后，你需要将它们导入你的细胞。由于载体比较大，转染可不太容易。这时你可使用脂质体转染试剂，如Lipofectamine 3000，来改善转染，从而提高切割和重组的效率。

Lipofectamine 3000转染试剂是一种专为提高难转染细胞系的转染效率而开发的新型试剂。有了它，研究人员能够减少痛苦的下游优化。以下步骤可帮助你优化转染：

• 检验两种剂量：Lipofectamine 3000的操作方案建议检测两种剂量的转染试剂。这背后的理由是，每个实验室都以不同的方式培养不同的细胞系。即使是个人之间，培养转染所用的细胞的方式也存在差异。以两种剂量来开展实验将保证你达到这个细胞类型的转染最佳点。

• 使用OptiMEM低血清培养基：Lipofectamine 3000采用两管操作。首先用OptiMEM培养基来稀释Lipofectamine 3000试剂，然后用OptiMEM培养基来稀释DNA，并加入P3000™试剂。之后以1:1的比例将稀释好的DNA与稀释好的Lipofectamine 3000混合，孵育5分钟。脂质体-DNA复合物即可直接添加到完全培养基的细胞中。

• 控制细胞传代次数：大部分用于转染实验的细胞类型应该在解冻后的4代至25代之间。

• 优化细胞密度：细胞在转染当天的汇合度应在70%-90%。这能使转染效率提高10%-15%。

• 保持细胞健康：在传代过程中保持细胞处于对数生长期，并确保使用适当的培养基。

基因编辑的效率取决于核酸的设计和导入。使用GeneArt Precision TAL或GeneArt CRISPR Nuclease Vector以及转染效率更高的Lipofectamine 3000，将让你专注于真正重要的事情：科学研究。（生物通 余亮）