蛋白质印迹手册6：转印缓冲液

转印缓冲液提供了电极之间的电连续性，必须是导电的。它还提供了一个化学环境，能维持蛋白质的溶解度，又不妨碍转移过程中蛋白质吸附到膜上。对于大多数蛋白质样品，常见配方可实现这些功能。至于添加到缓冲液中的甲醇，它有什么功能呢？请看本文。

转印缓冲液

转印缓冲液提供了电极之间的电连续性，必须是导电的。它还提供了一个化学环境，能维持蛋白质的溶解度，又不妨碍转移过程中蛋白质吸附到膜上。对于大多数蛋白质样品，常见配方可实现这些功能。大部分缓冲液在转移过程中发生焦耳加热。基于这个原因，许多槽转印系统都配有内置的冷却管。转印槽还可以放在冷室内，而缓冲液可以在使用前经过预冷。在半干转印系统中，电极板还可作为散热片。但它们的散热能力有限，因此半干系统一般不用于长时间转印。

传统的转印缓冲液包含缓冲系统和甲醇。Towbin缓冲液（1979），Tris甘氨酸缓冲液，常用于槽转印系统中。这种缓冲液的pH值为8.3，比大多数蛋白的等电点（pI）要高。在凝胶上分离的蛋白质带负电荷，向阳极迁移。由于槽内的缓冲液是混合的，故转移过程中的离子分布保持相对恒定。

半干系统可利用单一或三重缓冲液系统（Kyhse-Anderson定义，1984）来运行。使用三重缓冲液，是因为转移是个等速电泳的过程，其中蛋白质在领先离子和尾随离子之间移动（Schafer-Nielsen等，1980）。在某些情况下，三重缓冲液系统可实现更好的定量转移。这三重缓冲液分别为：

• 阳极缓冲液I：0.3 M Tris，pH 10.4
• 阳极缓冲液II：25 mM Tris，pH 10.4
• 阴极缓冲液：25 mM Tris和40 mM ε-氨基己酸，pH 9.4

阳极缓冲液I中和阳极板表面产生的过量质子。阳极缓冲液II与阳极缓冲液I的pH值相同，但Tris浓度低至25 mM。阴极缓冲液包含ε-氨基己酸，作为转移过程中的尾随离子，并在阴极缓冲液中逐渐耗尽，因为它穿过凝胶向阳极移动。对于半干系统中采用单缓冲液，请查询制造商的建议。

尽管上面定义的缓冲液系统适用于大多数蛋白转印，但文献中包含许多变化，适用于不同的应用。最明显的变化之一是在蛋白测序应用中，建议使用10 mM CAPS缓冲液（pH 11）（Matsudaira，1987）。Towbin缓冲液中使用以及凝胶电泳缓冲液中残留的甘氨酸导致采用Edman原理的自动蛋白测序仪中出现高背景。通过改变转印缓冲液的配方，这种假象明显减少。缓冲液强度及组成的任何修改应小心进行，以确保转印装置不会过热。

转印缓冲液甲醇的功能

添加到转印缓冲液中的甲醇有两个主要功能：

• 稳定凝胶的尺寸。
• 从蛋白质分子上解离出复合的SDS。

聚丙烯酰胺是一种水凝胶，具有吸收水分的能力。在纯水中，各个维度的凝胶尺寸都有相当量的增加。溶胀度也取决于凝胶中所使用的丙烯酰胺的浓度。高浓度的凝胶比低浓度的凝胶溶胀得更多。梯度胶会明显突出这种影响，其底部高浓度的区域比顶部溶胀得更多。开始时是矩形的凝胶可能会变成梯形。添加到转印缓冲液中的甲醇能最大限度地减少凝胶溶胀，而转印操作通常也包括一个平衡步骤，以达到凝胶尺寸的稳定性。当甲醇浓度为10%-20%时，尺寸稳定性可相当快速地实现。当甲醇浓度较低时，平衡需要更长的时间才能实现。如果在转移过程中发生尺寸改变，蛋白质的分辨可能会损失。对于在甲醇中溶解度有限的高分子量蛋白质，甲醇的减低会导致蛋白转移效率明显提高，但这可能需要更长的平衡时间来确保尺寸稳定性。

甲醇的第二个功能对于蛋白质从包含SDS的凝胶上转移很关键。甲醇可帮助从蛋白质分子上解离所复合的SDS（Mozdzanowski和Speicher，1992）。尽管SDS对凝胶上单个蛋白质的分辨很必要，但是对于有效印迹却是极为不利的。首先，SDS的结合给蛋白质分子带来高的负电荷密度，导致蛋白质分子非常快速地穿过膜，减少在孔结构内的停留，从而降低分子间相互作用的机会。其次，通过包被蛋白质分子，SDS限制蛋白质与PVDF进行分子接触的能力。这些影响随着蛋白质的分子量降低而增加。甲醇通过解离SDS，并提高蛋白质分子与膜结合的可能性，从而减少这两方面的影响。

（实际内容以《蛋白质印迹手册》印刷版为准，如有错漏，敬请谅解）

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