专家经验谈：抗体制备法的利与弊

单克隆抗体一直是基础研究、医学诊断和疾病治疗中的重要工具。为了加快抗体研发的速度，The Scientist杂志联系了相关领域的一些专家，请他们分享了自己使用新兴技术进行抗体鉴定和分离的经验。

生物通报道：单克隆抗体一直是基础研究、医学诊断和疾病治疗中的重要工具。制备单克隆抗体的传统方法，是诺贝尔奖获得者Georges Köhler和César Milstein在上世纪七十年代开发出来的。这一方法包括：让小鼠接触特定抗原，收集它体内的抗体生产细胞，然后将这些细胞与骨髓瘤细胞融合，形成能够长时间体外培养的杂交瘤。这种技术可以帮助人们生产大量高度特异性的抗体。

然而，动物源的抗体不能用于人体治疗，因为它们会触发人体的免疫反应。为了在人体免疫细胞应答特定病原体时，获取细胞产生的抗体，科学家们又开发了一些新的方法。例如，从血样中分离记忆性B细胞，然后利用Epstein-Barr感染使这些细胞具有永生能力，再在其中筛选能够生成特异性抗体的细胞。“这个方法非常费劲，因为你要制备这些细胞系，对大量的细胞进行筛选，”芝加哥大学的免疫学副教授Patrick Wilson说。另外，不是所有的细胞都能在永生化过程中存活下来，这无疑限制了天然抗体的产量。

最近Wilson等人找到了一个新办法，他们从活跃应答病原体或疫苗的人类血液中，分离具有抗原特异性的单个B细胞，然后对细胞中编码抗体重链和轻链的两个基因进行克隆。这些基因的序列在不同细胞中是有差异的，“不能把细胞混在一起，因为那样你可能得到一个细胞的重链和另一个细胞的轻链”，这样就不能获得天然的重轻链组合。克隆了两个基因之后，就可以在此基础上生产重组抗体，这一技术也被称为表达克隆（expression cloning）。“这个技术没什么限制，只要分离到B细胞就可以制造相应的抗体，”Wilson说。“问题在于实验的步骤比较繁琐。”

表达克隆法最适合“在获得了大量抗原特异性细胞时使用，而这些细胞只有在疫苗接种或感染之后才会出现，”Wilson说。如果没有产生活跃的免疫应答，这个技术鉴定抗体就会非常吃力。因为血液中存在着数百万记忆性B细胞，它们都针对着不同的抗原。

上述技术都是鉴定新抗体和研究人类免疫应答的宝贵工具，不过这些技术都很耗时也比较复杂。为了加快抗体研发的速度，The Scientist杂志联系了相关领域的一些专家，请他们分享了自己使用新兴技术进行抗体鉴定和分离的经验。

基于细胞培养的方法

使用者：NIH国家过敏与传染病研究所的Mark Connors

项目：分离广谱而且强效的新HIV中和抗体

遇到的问题：HIV患者的抗体生产细胞永生化效率较低，就算成功永生化，一些克隆也并不稳定。此前有研究者通过荧光探针从血样中提取抗原特异性的记忆性B细胞，并由此获得HIV中和抗体。Connors及其团队希望在不依赖已知抗原的条件下，寻找新的HIV中和抗体。（延伸阅读：PNAS：常用HIV药物难以深入淋巴组织）

解决办法：Connors及其团队首先使用流式细胞仪从HIV感染者的血液中分离B细胞。他们并没有采用常规的表达克隆（克隆各个细胞的重链和轻链基因），而是将分离到的细胞分装在384孔板中。他们用滋养层细胞和信号分子保持B细胞的活性，同时刺激它们分泌抗体。在大约两周后，研究人员检验了每个孔上清液在体外中和HIV的能力。随后，他们选取了有中和能力的细胞，并对其中的抗体基因进行克隆，最后制成重组抗体。Connors和他的团队用这一方法，分离了两个能够强力中和多种HIV病毒株的新抗体。

优点：

•使用者不需要事先知道抗体的结合特异性

•可以用于多种疾病。“只要你有能够进行筛选的目标功能，就可以提取抗体，” Connors说。

•完成整个过程只需要三周，Connors说。

•滋养层细胞可以通过AIDS reagent program免费得到

缺点：

•中和分析所需的试剂比较贵

•理论上这一方案可以手动完成，但需要筛选的孔很多（Connors筛选了60,000–140,000个孔），因此这一技术更适合拥有自动化液体处理设备的实验室。

•一些抗体生产细胞可能在培养过程中无法存活。

成本：据Connors估计，每个384孔板大约需要$400–$500。手动操作一般需要约20块板，自动化实验操作一般需要60–80块板，具体还是要看血样中有多少B细胞。

 

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高通量DNA测序

使用者：德克萨斯大学的George Georgiou教授

项目：用高通量测序鉴定天然的人类抗原特异性抗体

遇到的问题：2010年Georgiou的研究团队向人们展示，可以通过免疫球蛋白基因的高通量测序，快速生产抗原特异性的抗体。随后，研究团队对小鼠进行免疫接种，然后选取了抗体生产细胞中表达量最为丰富的重链和轻链基因，将它们重组成为抗体。但这一方法无法辨别抗体生产细胞中的原始重/轻链配对。Georgiou发现，要想构建天然抗体，就要找到同时测序重链和轻链的方法。

解决办法：Georgiou的研究团队先用流式细胞仪从血液中纯化B细胞，将细胞一个个分配到125皮升的微孔中。随后他们裂解细胞，并用磁性微珠捕获重链和轻链的可变区mRNA（VH 和VL）。对这些mRNA进行PCR扩增，可以将VH和VL转录本结合在一起形成一个cDNA扩增子。在此基础上，研究人员可以通过测序和生物信息学分析来确定VH: VL的配对情况。

研究人员利用这一技术，在应答破伤风类毒素的抗体生产细胞中鉴定了86个重/轻链对。他们选择其中的10对制备了10种重组抗体，结果这些抗体都能够在体外与破伤风类毒素高亲和力结合。而之前的研究显示，通过重链和轻链随机配对生产的抗体，只有大约10%具备抗原特异性。

优点：

•非常快。“从分离细胞到获得全天然的人类重/轻链序列，只需要一周时间，”DeKosky说。

•可以鉴定抗体的天然序列

•不会漏掉罕见B细胞所编码的免疫球蛋白

•可以在免疫应答的过程中跟踪B细胞的发育

缺点：

•需要自制微孔芯片

•进行序列分析需要具备一定的生物信息学知识

成本：据DeKosky介绍，获得2,700对抗体基因序列，需要大约$550的试剂。

蛋白质组学技术

使用者：CST公司的首席科学家Roberto Polakiewicz

项目：鉴定实际存在于人类和动物血液中的抗体，并在此基础上生产具有高亲和力的重组抗体

遇到的问题：以细胞为基础的抗体制备策略（不论是B细胞永生化、表达克隆还是测序）都不能代表血液中真实存在的所有抗体。这是因为，有些细胞会在分离过程中死亡，而有些细胞编码的抗体可能并不释放到血液中去。“我们制备抗体的目的是对抗感染，” Polakiewicz说，所以“真正重要的是血液循环中的抗体，这些抗体才负责发现病原体并召集免疫细胞展开攻击。”为此，Polakiewicz及其同事希望开发一个策略，直接分析血液循环中的抗体。

解决方法：Polakiewicz的研究团队采用了蛋白质组学技术。他们先通过亲和纯化，从接种过乙肝疫苗的血液中分离和富集特异性的抗体。随后，研究团队用蛋白酶将这些抗体消化成多肽片段，并对它们进行质谱分析。为了解读这些质谱数据，研究人员测序了供体B细胞的抗体基因，并在此基础上建立了参考数据库。“不能使用整个基因组，” Polakiewicz说。“那样会给你生殖细胞系的B细胞序列，而我们需要的是免疫接种后从头生成的序列。”

通过比较免疫球蛋白的基因序列与多肽的质谱数据，研究人员鉴定和克隆了血液中的抗体重/轻链基因，并由此生产了多种重组抗体，这些抗体都能与乙肝病毒抗原高亲和力的结合。

优点：

•能够分析人体血液循环中出现的抗体成分

•可以用来跟踪血液抗体谱发生的变化

缺点：

•需要自制进行多肽和基因序列分析的生物信息学软件

•破坏了血液中抗体重/轻链的天然配对。

•需要使用者具备测序和质谱的专业知识

•比较费力，生成功能性的重组单克隆抗体需要21天

成本：Polakiewicz未能估算出这一方案的具体成本，但他指出这一方案的花销跟常用的方法差不多，甚至还可能更低一些。

 

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