Science综述：CRISPR技术革命

　　生物通报道：DNA编辑技术CRISPR近年来风生水起，已经开始取代了其它基因组编辑工具，如锌指核酸酶和 TALENs等。不过目前科学家们对于这一技术中的RNA引导核酸内切酶：Cas9了解的还不够多，如果能更精确的掌握这种酶在CRISPR系统中如何发挥作用的，将能提高这一技术的使用效率和特异性。

5月16日Science杂志发表了题为“Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution”的综述性文章，指出近期的一些生化试验和结构研究有助于解析Cas9这种关键酶，这些研究成果为未来合成生物学，转化医学研究，以及新一代基因组工程中的新应用奠定了基础。

CRISPR本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的CRISPR位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA 。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达CRISPR相关酶，也就是Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA ，阻止病毒完成其功能。

将CRISPR/ Cas系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个Cas酶，用于切断靶标DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一个就是称为导向RNA（gRNA）的RNA分子，这种分子能通过互补结合靶标。

其中Cas酶至关重要，为了能更好的利用这一技术工具，不少实验室解析了这种酶的精确分子机制，探索其如何靶向和作用于DNA的。近期Sternberg等人就确定了Cas9在病毒感染过程中是如何在RNA序列的引导下识别和降解外源DNA，以及在动物和植物细胞中诱导位点特异性遗传改变的。

研究人员通过结合单分子成像和大量的生化试验，证实Cas9的基因组编辑能力是通过称作为“PAM”（ protospacer adjacent motif）的短DNA序列来实现的。这一研究揭示了PAM的两个主要功能，解释了它对于Cas9能够靶向和切割与导向RNA相匹配的DNA序列如此至关重要的原因。在外源DNA的靶向位点附近存在PAM，而宿主基因组的这些靶向位点则缺乏PAM，使得Cas9能够精确区分必须降解的非自身DNA和几乎完全相同的自身DNA。此外，存在PAM也是激活Cas9酶的必要条件。

研究人员指出，Cas9只在识别PAM后才利用RNA–DNA碱基配对来解读DNA寻找匹配的序列，这样避免了意外地靶向细菌自身基因组中的匹配位点。然而，即使Cas9以某种方式与自身基因组中的一段匹配序列错误地结合，没有PAM也无法触发催化核酸酶的活性。利用这种DNA解读机制，PAM提供了两个冗余的检查点，确保Cas9不会错误地破坏它自身的基因组DNA。

此外，在结构研究方面，瑞士苏黎世大学、美国加州大学伯克利分校等处的研究人员今年2月首次解析出酶Cas9的详细三维结构图：研究人员利用X射线晶体分析法获得两种主要类型的Cas9酶的2.6埃和2.2埃分辨率的晶体结构图。然后利用单颗粒电子显微术(single-particle electron microscopy)揭示出Cas9与它的导向RNA(guide RNA, gRNA)如何合作从而与靶DNA序列相互作用。

结构分析显示Cas9具有相同的结构核心，这个结构核心的特征为一种具有两个主叶(major lobe)——一个核酸酶结构域叶和一个α-螺旋叶---的蛤蜊形状(clam-shaped)的结构。这两个主叶含有保守性的裂缝，而这些裂缝在核酸结合中发挥功能。

还有来自麻省理工等处的研究人员首次报道的Cas9复合体的高分辨率图片，从中揭示出这种Cas9复合体的劳动分工。

研究人员发现Cas9由两个裂片(lobe)组成：一个裂片参与识别向导RNA和靶DNA组分，另一个裂片负责切割靶DNA，导致双链DNA断裂从而让靶基因失去功能。而且他们也发现Cas9与导向RNA之间的界面上的关键性结构，当Cas9准备切割靶DNA链时，这些结构允许Cas9在导向RNA和靶DNA周围自我组装。

这些生化机理和结构上的重要成果将有助于解决CRISPR系统应用中的一些问题，从而更好的改进CRISPR技术，满足科学家们的要求。（生物通：张迪）

原文摘要：

Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution

The ability to add, remove, or change DNA sequences is essential to studies that investigate the genetic under-pinning of phenotypic traits. With its unprecedented effi ciency and stunning ease of use, DNA editing technology based on the prokaryotic CRISPR (clustered regularly interspersed short palindromic repeats)Cas9 system is completely revolutionizing genome engineering. In little more than a year, CRISPR-Cas9 editing has been implemented in a multitude……