北大生科院PNAS发布单细胞测序新技术

来自北京大学生命科学学院等处的研究人员开发出了一种新型微流控单细胞全转录测序新方法，这种方法有效地消除转录组高度动态特性所带来的测量差异，提高单细胞全转录组分析的准确性和可靠性。

　　生物通报道：来自北京大学生命科学学院等处的研究人员发表了题为“Microfluidic single-cell whole-transcriptome sequencing”的文章，开发出了一种新型微流控单细胞全转录测序新方法，这种方法有效地消除转录组高度动态特性所带来的测量差异，提高单细胞全转录组分析的准确性和可靠性。

这一研究成果公布在《美国国家科学院院刊》（PNAS）杂志上，文章的通讯作者分别是北京大学生物动态光学成像中心的赵亮博士，黄岩谊教授和汤富酬教授。生物动态光学成像中心（Biodynamic Optical Imaging Center, BIOPIC）是北京大学于2010年成立的一个跨学科合作实体研究中心。中心的目标是发展和利用最先进的生物成像与基因测序手段，在分子和细胞水平上进行生命科学与医学基础研究。该中心聚集了多位知名的科学家，如谢晓亮，庄小威等。

近年来不断发展的实验技术，提供了更加定量与客观的证据，表明在许多关键生命过程例如胚胎发育、细胞分化、疾病发生与发展等过程中，特定的单个细胞行为，以及其间的个体化差异与异质性，导致了极其重要甚至是决定性的结果。而之前基于大量细胞平均测量所获得的结果并无法正确反映复杂生物体系的全面真实信息，严重掩盖了独立个体样本的行为以及生命现象中大量存在的随机行为。针对单个细胞的研究，是细胞生命分析技术所追求的极限状态，是对传统技术极大的挑战。

2014年年初，Nature Methods将单细胞测序选为年度最重要的方法学进展，这一技术利用新一代的测序技术来分析单个细胞内的基因信息，成为解读单细胞的最佳工具，无论是对于胚胎发育，还是癌症研究都具有重要的意义。

单细胞全转录组测序是单细胞高通量测序需求量最大的应用，它所测定的是单个细胞内所有基因的表达量，同时还可以测定除了mRNA分子外，其他长非编码RNA（lncRNA）以及小RNA的含量，定量获取单个细胞完整的表达谱。2013年，汤富酬研究组、李瑞强研究组与北医三院的乔杰教授合作，利用单细胞转录组测序技术，分析了不同时期的人类早期胚胎细胞的基因表达情况，这一研究发现了两千多个全新的可能参与早期胚胎基因表达调控的长非编码RNA。

然而目前采用的新一代测序技术中，绝大多数方法都需要特定的前处理过程，制备“测序文库”。而针对单细胞样品，已有的方法均存在很多缺陷，导致检测灵敏度不高、基因表达信息丢失严重、技术噪音高、操作失误率高、重复性差。为了解决这一问题，在最新这项研究中，研究人员合作开发了新的文库制备方法，将最关键的单细胞转录组文库构建步骤集成在一个微流控芯片上，可以同时进行多个样品的操作。

这一技术的开发，大大减少了试剂用量，在反应效率得到提升的同时极大地抑制了污染的发生，还减少了操作误差，实现了更高的可靠性和更好的平行性。

研究人员通过对几十个细胞的分析表明，这一方法可以有效地消除转录组高度动态特性所带来的测量差异，实现对单细胞异质性的分析和判断。通过多个细胞较低深度的转录组测序，可以获取比同等成本下单个细胞高深度测序更重要的细胞异质性信息，而更好地展现生物体系的复杂性、随机性和动态过程。而通过微流控芯片上的精确细胞操控和主动俘获过程，还可以摆脱其他类似方法中随机俘获的局限性，实现对极其少量细胞的完全俘获和反应前的表型观察，以更好地理解和验证单个细胞的异质性。与已有的技术相比，这一工作展示了目前最好的单细胞转录组测序检测灵敏度和平行性。

此前这一研究组还开发了一种全新的活细胞成像技术，利用炔基标记手段并巧妙地应用了受激拉曼显微成像技术，成功实现了对活细胞的脂类、核酸、蛋白质和糖类等关键生物分子的特异性、低干扰的三维成像，突破了成像标记基团的尺寸极限。（延伸阅读：活细胞成像新技术）
（生物通：万纹）

原文摘要：

Microfluidic single-cell whole-transcriptome sequencing

Single-cell whole-transcriptome analysis is a powerful tool for quantifying gene expression heterogeneity in populations of cells. Many techniques have, thus, been recently developed to perform transcriptome sequencing (RNA-Seq) on individual cells. To probe subtle biological variation between samples with limiting amounts of RNA, more precise and sensitive methods are still required. We adapted a previously developed strategy for single-cell RNA-Seq that has shown promise for superior sensitivity and implemented the chemistry in a microfluidic platform for single-cell whole-transcriptome analysis. In this approach, single cells are captured and lysed in a microfluidic device, where mRNAs with poly(A) tails are reverse-transcribed into cDNA. Double-stranded cDNA is then collected and sequenced using a next generation sequencing platform. We prepared 94 libraries consisting of single mouse embryonic cells and technical replicates of extracted RNA and thoroughly characterized the performance of this technology. Microfluidic implementation increased mRNA detection sensitivity as well as improved measurement precision compared with tube-based protocols. With 0.2 M reads per cell, we were able to reconstruct a majority of the bulk transcriptome with 10 single cells. We also quantified variation between and within different types of mouse embryonic cells and found that enhanced measurement precision, detection sensitivity, and experimental throughput aided the distinction between biological variability and technical noise. With this work, we validated the advantages of an early approach to single-cell RNA-Seq and showed that the benefits of combining microfluidic technology with high-throughput sequencing will be valuable for large-scale efforts in single-cell transcriptome analysis.