腺相关病毒（AAV）研究的完整方案[新品推荐]

腺相关病毒（Adeno-Associated Virus，AAV）是大家很熟悉的病毒，即使没用过，至少也听过。AAV属于细小病毒科的成员，能感染多种细胞。由于其安全性好、宿主细胞范围广（分裂和非分裂细胞）、不整合到宿主细胞基因组，AAV成为基因治疗中的得力工具。

从重组载体的构建，到病毒颗粒的制备，似乎是个漫长的过程。有些研究人员迟迟不愿动手，就是害怕过程太复杂。其实，这已经是一套很成熟的技术，市场也有完整的产品提供。Clontech（Takara旗下公司）就为腺相关病毒的研究提供了一整套工具。

重组载体的构建

AAV Helper Free System能够制备高滴度的AAV颗粒，而无需使用辅助病毒。此试剂盒中包含三个质粒，提供了制备重组AAV颗粒的必要元素。pAAV-CMV是克隆目的基因（GOI）的质粒，包括基因表达的CMV启动子和两个ITR。大家要注意的是，目的基因大小应当在2.5 kb以内，因为包装时存在限制。pRC2-mi342携带了AAV2的Rep和Cap基因以及has-miR-342的表达框。has-miR-342是一种人类microRNA，能将AAV2的滴度提高2倍。pHelper质粒则包含了腺病毒E2A、E4和VA，这些基因是AAV生产所必需的。

构建好重组载体之后，即可将这三个质粒共转染HEK293或HEK293T细胞。至于多质粒的转染，Clontech建议使用磷酸钙转染试剂盒（CalPhos Mammalian Transfection Kit）或Xfect转染试剂。在转染后2-3天，即可收集病毒颗粒。

轻松的AAV颗粒收集

从产生重组病毒颗粒的细胞中分离AAV颗粒通常是会采取冻融法或超声波法。不过，这些方法很耗时，或需要特殊的设备。AAVpro Extraction Solution就提供了一种简便而高效的方法。你只需将此试剂添加到产病毒的细胞中，再通过离心回收病毒颗粒即可。提取出的AAV颗粒溶液中只包含少量的宿主蛋白和核酸，适用于细胞转染或进一步的纯化。与冻融法相比，病毒颗粒的产量至少提高了3倍。

高纯度AAV颗粒的制备

当然，对细胞转染而言，粗制的病毒颗粒也许已足够，但若是将AAV导入动物，还是需要高纯度的病毒颗粒，不含有任何残留的细胞或培养基中的杂质。对于病毒颗粒的纯化，大家通常采用氯化铯密度梯度离心。不过，这可是个麻烦的方法，也需要一定的技巧，才能获得高的产量。

对新手而言，AAVpro Purification Kit (AAV2) 可能是个更好的选择。它能够快速、轻松地从生产病毒的细胞中纯化AAV2病毒颗粒。细胞经AAVpro Extraction Solution初步纯化后，利用核酸酶处理，再让AAV2颗粒与预装柱结合，经过洗涤和洗脱，即可得到高纯度的AAV颗粒。整个过程在4小时内完成。

快速确定AAV滴度

在转导病毒前，测定病毒滴度也是必要的。病毒滴度通常用点杂交、ELISA等方法来测定，但Real-Time PCR法则更加精确和快速。AAVpro Titration Kit (for Real Time PCR) 提供了必要的试剂，可从细胞中提取出AAV颗粒，并对病毒基因组序列进行定量PCR分析。定量是基于AAV2的ITR的扩增，因此可测定各种类型的AAV。（生物通 余亮）

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