南开大学陈凌懿教授发表CRISPR新成果

【字体: 时间:2014年04月24日 来源:生物通

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  利用抗生素进行筛选,是分子克隆的一个关键步骤。日前,南开大学的研究者们以CRISPR/Cas技术为基础,开发了一个重复利用抗生素抗性的简单筛选方法,这一方法非常适用于多步骤的基因工程改造。

  

生物通报道:利用抗生素进行筛选,是分子克隆的一个关键步骤。日前,南开大学的研究者们以CRISPR/Cas技术为基础,开发了一个重复利用抗生素抗性的简单筛选方法,这一方法非常适用于多步骤的基因工程改造。

对于一个分子生物学实验室来说,抗生素抗性基因几乎是不可或缺的。虽然这些基因是鉴定正确克隆的有力工具,但抗生素抗性基因有数量限制,束缚了人们进行复杂基因工程改造的能力。

南开大学生命科学学院的陈凌懿教授在四月份的BioTechniques杂志上发表文章,描述了一个在几轮克隆中重复进行一种抗生素筛选的简单方案。这一技术将为哺乳动物细胞的基因工程改造带来可喜改变。

去除抗生素抗性基因,就可以在进一步基因改造时,继续使用同一种抗生素进行筛选。为此,研究人员采用了被称为CRISPR/Cas的新技术。CRISPR/Cas是一个新兴的基因组编辑工具,能够定向切割特定的DNA片段。(相关文章:Nature子刊:巧解基因编辑脱靶问题

陈教授的研究团队通过软件搜索了针对嘌呤霉素抗性基因puro的引导序列,引导序列负责将CRISPR/Cas机器引导到正确的靶点。他们选择了脱靶效应最小的引导序列,并将其克隆到相应的质粒上与Cas9共表达。

研究人员通过CRISPR/Cas系统,在小鼠胚胎干细胞系中破坏了嘌呤霉素抗性基因,并使用PCR和测序验证了puro基因中的缺失。随后,他们用含有puro基因的载体转染这些细胞,恢复了进行嘌呤霉素抗性筛选的能力。

在此之前,人们一般用Cre-loxPFlp-FRT重组系统去除抗生素筛选基因。但陈教授认为,CRISPR/Cas系统更加实用。“我们的方案最适合于多步骤的基因组工程改造。尤其是当抗生素抗性基因两侧没有预先设计LoxPFRT位点时。”

尽管CRISPR/Cas的应用近来已经发表了不少文章,陈教授认为这还只是一个开端。“研究显示,CRISPR/Cas技术是一个有力的基因组编辑工具,可以完成常规或条件性的基因敲除和敲入。可以想见,最终人们将能利用CRISPR/Cas技术在患者体内校正基因缺陷和突变。”

陈凌懿教授简介:

所属部门:遗传学和细胞生物学系

招生专业:细胞生物学

研究方向:小鼠胚胎早期发育中转录编程的调控机制;胚胎干细胞的发育多能性的分子机制;建立诱导

1999        北京大学  学士

2004        美国西北大学  博士

2005--2008   美国哈佛大学  博士后

2008--      南开大学生命科学学院  教授、博导

 

生物通编辑:叶予

生物通推荐原文摘要:

Inactivation of an integrated antibiotic resistance gene in mammalian cells to re-enable antibiotic selection

Removing an antibiotic resistance gene allows the same antibiotic to be re-used in the next round of genetic manipulation. Here we applied the CRISPR/Cas system to disrupt the puromycin resistance gene in an engineered mouse embryonic stem cell line and then re-used puromycin selection in the resulting cells to establish stable reporter cell lines. With the CRISPR/Cas system, pre-engineered sequences, such as loxP or FRT, are not required. Thus, this technique can be used to disrupt antibiotic resistance genes that cannot be removed by the Cre-loxP and Flp-FRT systems.

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