微滴式数字PCR技术的七大应用[创新技巧]

作为定量PCR领域的一颗新星，数字PCR的研究成果在这两年频频见报。数字PCR市场也正以令人惊叹的速度发展。这一切要归功于新平台的上市以及新应用的开发。在早期采用者和仪器制造商的努力下，新的dPCR应用被不断开发出来，让研究人员“有一点动心”。近日，James D. Bennett博士在Bioradiations上介绍了Bio-Rad微滴式数字PCR系统的7个应用。

作为定量PCR领域的一颗新星，数字PCR的研究成果在这两年频频见报。数字PCR市场也正以令人惊叹的速度发展。据Frost & Sullivan预计，2011-2016年间dPCR仪器市场将以52%的年均复合增长率增长。

这一切要归功于新平台的上市以及新应用的开发。在早期采用者和仪器制造商的努力下，新的dPCR应用被不断开发出来，让研究人员“有一点动心”。近日，James D. Bennett博士在Bioradiations上介绍了Bio-Rad微滴式数字PCR系统的7个应用。

微滴式数字PCR（ddPCR）系统能将一份样品分成20,000个纳升级的微滴，带来了目标分子的绝对定量，而不需要标准曲线。去年，Bio-Rad推出了第二代产品QX200™ ddPCR系统，能够兼容EvaGreen和探针型检测试剂，从而有望实现更多的应用。下面就让我们来看看ddPCR平台如今主要用在哪些方面。

定量癌症标志物

癌症标志物的检测让我们能够对肿瘤存在、发病过程及预后作出判断。在此过程中，我们要对那些小但明显波动的遗传变异进行检测。利用ddPCR技术，研究人员能够观察到突变的微小差别，从而更好地判断它们在癌症中的潜在作用。

与野生型DNA的背景下，癌症相关突变因浓度低，往往逃过检测。QX200微滴式数字PCR系统以其高灵敏度，能够轻松定量低至0.0001%的突变，这是其他方法无法做到的。之前，MolecularMD公司利用QX100 ddPCR系统，开发出肺癌EGFR微创诊断技术。他们认为，QX100是检测稀有事件（如T790M突变）的理想工具，其灵敏度高于real-time PCR十倍左右。

了解病毒载量

在确定疾病状态和开发有效疗法时，精确地定量病毒载量至关重要。病毒库不断波动，有时会降至极低的水平。在研究许多不同的病原体时，成功和失败之间也许就一步之遥，那就是能够准确重复地测定病毒DNA或RNA。

QX200 ddPCR系统能够定量极少量的病毒遗传物质，并将其与复杂的背景区分开。研究人员也可通过逆转录产生cDNA，进而获得病毒RNA的真实拷贝。QX200系统为用户带来了精确度、可靠性，以及高效处理样品所需的通量。

之前，美国密西西比州一名出生时携带艾滋病毒的婴儿，经过抗逆转录病毒的治疗，已经被“功能性治愈”。在这个案例中，ddPCR平台发挥了重要的作用。研究人员表示，它通过将样品随机分布在上万个微滴中进行PCR扩增，从而确保了高度灵敏而准确的HIV DNA低拷贝分析。

区分基因组变异

拷贝数变异（CNV）是人类基因组中个体差异的一个重要来源。CNV与癌症、神经和自身免疫疾病以及药物的不良反应存在关联。可靠地鉴定此类CNV，也代表了前沿研究中一种重要的能力。

拷贝数评估中的主要技术障碍是区分连续的拷贝数状态。一般来说，随着拷贝数状态的增加，各个状态之间目标序列的百分比差异减小，这让CNV的测定更加困难。QX200 ddPCR系统以其高灵敏度，能够区分连续的拷贝数状态（如5 vs. 6），且有着出色的统计置信度。

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新一代测序的验证

在新一代测序的样品制备中，准确定量测序文库很关键，这可保证测序平台的高效利用。若测序运行时的文库分子过多或过少，都会使数据质量受损，有时甚至没有数据。这不仅浪费宝贵的样品和试剂，也浪费用户和仪器的时间。QX200 ddPCR系统可以融入NGS的文库制备流程中，精确定量测序文库。

美国福瑞德•哈金森癌症研究中心的研究人员去年在《BioTechniques》杂志上发表文章，称ddPCR可作为一种精确的方法，用于NGS文库的质量控制。他们利用QX100 ddPCR系统开发出一种新的分析，可测定未知DNA模板的绝对浓度和大小分布，优于其他方法。

此外，在NGS运行后，ddPCR也可用来验证NGS所获得的结果，包括基因组改变，如SNP、突变和拷贝数变异。

基因表达分析

准确定量样品中存在的RNA转录本，有助于更好地了解基因表达和调控。QX200 ddPCR系统以其高灵敏度，特别适合发现和定量稀有转录本，让研究人员更深入地探究单细胞转录组学，并更好地了解RNA的实际功能。同时，QX200的高精确度也使其能够检测样品之间基因表达的微小变化。

去年发表在《Nature Methods》上的一篇文章称，ddPCR技术能在不同情况下，准确重复地定量血浆和血清中的microRNA。作者认为：“ddPCR能帮助我们更加精确地追踪病人在治疗期间不同时间段中的血清microRNA浓度变化情况，这对于实时PCR来说，有时是不可能实现的。”

转基因检测

测定转基因生物（GMO）中转基因拷贝的数量，对于确保这些产品符合法规和标签要求是至关重要的。QX200 ddPCR系统凭借其精确度和高通量，为按照国际标准分析GMO食品提供了一个可靠的平台。通过绝对定量转基因浓度，ddPCR带来了比qPCR更好的重复性和经济性，特别是在分析低浓度的目标时。

环境监测

基因目标的环境监测，需要对复杂样品中低浓度的目标进行准确检测。QX200 ddPCR系统在每次运行中创建数千个PCR反应室，带来了目标的准确测定，即使它们浓度很低。由于这些结果是通过分析数千个反应而得出的，它们对PCR抑制剂的耐受性更好，而在real-time PCR反应中，这些抑制剂有时会改变反应动力学。多个监测机构在多个地点工作时，绝对定量比相对定量能产生更加标准化的数据。（生物通 余亮）

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