SMRT测序改善CRISPR效果的评估[创新技巧]

新兴的CRISPR技术在短短一年多的时间内掀起了基因组编辑的热潮。然而，对于这些基因改造手段的效率和结果，我们仍难以评估。最近，单分子测序带来了一个好消息。研究人员证实，单分子实时（SMRT）测序技术能够同时测定任何位点的基因组编辑结果。这项研究成果发表在3月27日的《Cell Reports》上。

新兴的CRISPR技术在短短一年多的时间内掀起了基因组编辑的热潮。然而，对于这些基因改造手段的效率和结果，我们仍难以评估。目前的一些工具如荧光报告基因、克隆分析，缺乏生成报告细胞系时所需的灵敏度。高通量测序方法虽然能克服这一问题，但无奈读长太短，而供体DNA模板往往很长。

到目前为止，还没有一种测序平台能够同时评估非同源性末端接合（NHEJ）和同源介导修复（HDR）的发生频率，而这正是双链DNA断裂的两种主要修复机制。最近，单分子测序带来了一个好消息。研究人员证实，单分子实时（SMRT）测序技术能够同时测定任何位点的基因组编辑结果。这项研究成果发表在3月27日的《Cell Reports》上。

研究由斯坦福大学的Matthew Porteus领导。研究人员在文中指出，这种方法可应用于各种基因组编辑平台，包括TALEN、CRISPR/Cas9和锌指核酸酶（ZFN），以确定理想的改造结果出现时的条件和策略。

靶向基因组编辑让研究人员能够在基因组中几乎任何位点引入精确的序列修饰。然而，研究人员指出，这些基因组修饰策略并不总是带来理想的结果。“精确的基因组修饰……取决于断裂是由NHEJ修复的，还是由HDR修复的。如果断裂由NHEJ修复，在断裂位点可能会引入小的插入或缺失。不过，若由HDR修复，就能引入理想的序列变化，形成特定修饰。”

在这篇文章中，研究人员介绍，Pacific Biosciences公司的SMRT DNA测序带来15 kb的读长，实现了基因编辑频率的分析。在基因组编辑技术中，人们广泛使用有着长长一段同源臂的供体模板，以提高原代细胞的HDR效率。

作者认为，SMRT DNA测序带来了以下优点：(1) 灵敏测定任何细胞类型中的基因组编辑，包括原代干细胞，而不需要构建稳定的报告细胞系；(2) 测定内源位点的修饰，而不管其转录状态如何；(3) 在使用携带长的同源臂的供体模板时，长的测序读长带来了清晰的DNA修复结果。

此外，作者还提到：“我们的策略为研究DNA修复的通路提供了一种方法，而之前的方法难以研究。SMRT DNA测序能够灵活评估任一位点的基因组编辑结果，而不需要开发报告系统，从而简化了基因组编辑项目的开发，也扩展了这些技术的应用。”（生物通 薄荷）

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原文检索

Hendel et al., Quantifying Genome-Editing Outcomes at Endogenous Loci with SMRT Sequencing, Cell Reports (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2014.02.040