《PLOS ONE》:廉价、快速和详细的蛋白质分析新技术

在2014年3月24日的《PLOS ONE》杂志发表的一项最新研究，报道了一种创新性的蛋白质分析技术，研究人员利用这种廉价、快速和详细的蛋白质分析技术，获得了详细的蛋白质信息，包括翻译后修饰和遗传变异。

　　

生物通报道：蛋白质是几乎所有生命过程的重要参与者，包括细胞生长、修复和信号转导，化学反应催化和防御感染。因此，只要能够在临床上鉴定和评估它们，蛋白质就能够提供健康和疾病的重要标志。

对用于治疗和诊断目标的蛋白质进行准确定性，一直是医学界的一个巨大挑战。亚利桑那州立大学生物设计研究所生物标记物实验室的研究焦点在于，利用质谱分析法（mass spectrometry，MS）——详细调查蛋白质结构的强大工具——分析蛋白质。

这一领域的先驱者Randy Nelson是研究的指导者，研究人员利用质谱免疫（MSIA）技术——一种高通量的蛋白质定量技术，获得了详细的蛋白质信息，包括翻译后修饰和遗传变异。当前，该研究小组的重点是，开发新的分析方法，寻找癌症、糖尿病和心脏病相关的蛋白质生物标记物。

相关研究结果发表在2014年3月24日的《PLOS ONE》杂志，第一作者Paul Oran博士及其同事证明了MSIA平台的力量。研究报道了一种高通量方法，可以每天超过1000份人组样本的速度，定量和定性胰岛素样生长因子1（IGF1）。IGF1是参与人类生长障碍以及某些类型癌症的一种关键蛋白质。

胰岛素样生长因子1是一个70氨基酸的蛋白质，参与细胞生长、分化和转化。大多数IGF1是由肝脏分泌，起内分泌激素的作用。Oran指出：“几十年来，研究人员一直很难准确地量化IGF1，这种用于诊断各种生长障碍的重要分子。”

这项新研究提供的质谱法IGF1试验，可望有一天能够用于临床，此外，研究还首次报道了这项新技术是如何的高效和划算。在研究中，研究人员能够在一天内分析超过1000个样本（最终临床应用所需要的一个里程碑）。Oran博士表示：“这是第一次证明能以这个速度和成本运行、用于IGF1的靶向蛋白质组学MS试验。”

质谱法可以很容易地在蛋白质水平上识别表达的遗传变异（例如单核苷酸多态性SNPs）。这样的变化可能会改变或抑制所产生蛋白的功能。此外，质谱分析可以找出翻译后修饰后发生的一些变化。

与翻译后蛋白改变相结合的一个已知基因多个变异的复杂情况，被称为微观不均一性（Microheterogeneity）。产生的蛋白质变体在各种疾病中发挥重要的作用，但是研究人员一直很难识别这些变体。当前许多蛋白定量的临床标准是酶联免疫吸附测定法（ELISA）。

然而，质谱法能分析关键蛋白，而ELISAs却不能。在ELISA检测中，微观不均一性也会产生干扰，使实验出现机械故障，产生虚假读数。质谱法分析能够解决干扰问题，还能产生ELISA不能获得的丰富的蛋白信息。Oran称：“如我们和其他人已经多次看到的，微观不均一性与许多疾病形式有关。”

质谱仪是一种能够生成样本中所含分子的分子量光谱的分析仪器。一旦准备在质谱仪上进行样品分析，那么就可以通过蛋白及其变体独特的质量电荷比，将它们进行分离和分类，这提供了一种分子指纹。

在本研究的情况下，在血液中检测到的IGF1分子，通常会结合两种其他蛋白质。Oran称：“为了准确地量化这种分子，我们必须先破坏这种复合物，这样我们才能得到整个IGF1的准确读数。”

本研究描述的这种平台，是一种所谓的“自上而下”的蛋白质定量分析方法。用蛋白酶（如胰蛋白酶）消化蛋白质，提取得到的小肽片段用于质谱法分析是“自下而上法”，与此不同，“自上而下”法能够捕获一个完整长度的蛋白质和任何完整的蛋白质变体，使研究人员能够快速地分析蛋白质及其变体。Oran称：“其他那些‘自下而上法’难以确定，从而会忽视微观不均一性，成本大幅度增加，并且每个样本需要更多的时间和劳动力。”

在目前的研究中，研究小组在9小时内量化了1,045个人组样本，产出率可与ELISA相提并论，同时，只有通过质谱法才能提供关于IGF1蛋白的更详细信息。新方法还在大约1%的测试样品中，检测到了突变。

为了支持在临床上使用这种检测，未来的研究还将需要更大的验证研究。人类蛋白的“大宇宙”为我们提供了广泛的、合理的诊断靶标。Nelson实验已经使用该技术在进行几十个试验。Oran表示：“根据我们的知识，这真是临床实验室常规分析的第一个可行选择，这种方法符合成本和时间要求。”（生物通：王英）

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生物通推荐原文摘要：
Parallel Workflow for High-Throughput (>1,000 Samples/Day) Quantitative Analysis of Human Insulin-Like Growth Factor 1 Using Mass Spectrometric Immunoassay
Abstract: Insulin-like growth factor 1 (IGF1) is an important biomarker for the management of growth hormone disorders. Recently there has been rising interest in deploying mass spectrometric (MS) methods of detection for measuring IGF1. However, widespread clinical adoption of any MS-based IGF1 assay will require increased throughput and speed to justify the costs of analyses, and robust industrial platforms that are reproducible across laboratories. Presented here is an MS-based quantitative IGF1 assay with performance rating of >1,000 samples/day, and a capability of quantifying IGF1 point mutations and posttranslational modifications. The throughput of the IGF1 mass spectrometric immunoassay (MSIA) benefited from a simplified sample preparation step, IGF1 immunocapture in a tip format, and high-throughput MALDI-TOF MS analysis. The Limit of Detection and Limit of Quantification of the resulting assay were 1.5 μg/L and 5 μg/L, respectively, with intra- and inter-assay precision CVs of less than 10%, and good linearity and recovery characteristics. The IGF1 MSIA was benchmarked against commercially available IGF1 ELISA via Bland-Altman method comparison test, resulting in a slight positive bias of 16%. The IGF1 MSIA was employed in an optimized parallel workflow utilizing two pipetting robots and MALDI-TOF-MS instruments synced into one-hour phases of sample preparation, extraction and MSIA pipette tip elution, MS data collection, and data processing. Using this workflow, high-throughput IGF1 quantification of 1,054 human samples was achieved in approximately 9 hours. This rate of assaying is a significant improvement over existing MS-based IGF1 assays, and is on par with that of the enzyme-based immunoassays. Furthermore, a mutation was detected in ~1% of the samples (SNP: rs17884626, creating an A→T substitution at position 67 of the IGF1), demonstrating the capability of IGF1 MSIA to detect point mutations and posttranslational modifications.