Lonza Nucleofector™技术在糖尿病研究中的应用[创新技巧]

现阶段糖尿病的研究主要采用细胞作为研究模型，希望能够从分子层面研究糖尿病的形成、发病、遗传机制，争取能够通过分子手段治疗糖尿病，尤其是治疗具有家族遗传性的糖尿病。在以细胞为模型的糖尿病研究中，基因有限公司代理的Lonza核转染系统发挥了非常关键的作用，有效地提高了细胞的转染效率，保证了实验的顺利开展，为许多科学家发表高水平研究论文奠定了坚实的实验基础。

  糖尿病是一种因体内胰岛素绝对或相对不足所导致的一系列临床综合症，与遗传基因有着非常密切的联系。糖尿病的主要临床表现为多食、多饮、多尿和体重下降（“三多一少”），以及高血糖、尿糖等。

  世界卫生组织将糖尿病分为四种类型：Ⅰ糖尿病、Ⅱ型糖尿病、妊娠期糖尿病和其他类型糖尿病。不同类型的糖尿病都会导致胰岛β细胞不能产生足量的胰岛素或机体不能够有效利用胰岛素，用以降低血糖的浓度，从而导致高血糖的发生。Ⅰ糖尿病也称胰岛素依赖型糖尿病，是由于自身免疫系统破坏胰岛β细胞导致的，是一种先天家族性遗传病；Ⅱ型糖尿病也叫做非胰岛素依赖型糖尿病，是由于机体组织、细胞的胰岛素抵抗，胰岛β细胞功能衰退等原因引起的；妊娠期糖尿病是由于妊娠期分泌的激素使机体产生胰岛素抵抗引起的，分娩后治愈。遗传性胰岛素抗拒、胰脏疾病、荷尔蒙失调等也会导致糖尿病。

  糖尿病是对人类健康威胁*为严重的疾病之一，一直以来都是科学家们研究的重点。目前，Ⅰ糖尿病、Ⅱ型糖尿病尚不能完全治愈，所以现阶段的科学研究都是围绕这两类糖尿病而展开。

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  现阶段，糖尿病的研究模型主要有糖尿病鼠活体模型和细胞模型。细胞模型主要是从分子层面研究糖尿病的形成、发病、遗传机制，争取能够通过分子手段治疗糖尿病，尤其是治疗具有家族遗传性的糖尿病。在现代医学和生物学研究中，常用于糖尿病研究的细胞有THP-1，鼠原代CD4+T细胞、原代主动脉内皮细胞、小鼠胰岛瘤细胞系（MIN6）、Hela细胞、冠状动脉平滑肌细胞（CASMCs）、HL60、人视网膜色素上皮细胞系（ARPE-19）、人PBMCs细胞、RBL-2H3等细胞。在以细胞为模型的研究当中，科研人员需要将感兴趣的外源物质（质粒DNA、siRNA等）高效地转入细胞中，已达到对目的基因进行干扰的目的；但上述提到的这些常用细胞都是非常难转染的细胞，利用常规的转染方法很难将外源基因高效地转入细胞中，所以选择一个合适的细胞转染方法对实验的顺利开展就显得至关重要了。在之前的糖尿病研究当中，为了能够对细胞进行高效率的转染，很多科学家都选择了Lonza核转染技术作为细胞转染的方法和手段，实现了细胞的高效转染，并取得了满意的实验结果。

  Marina Cardellini[1]等以冠状动脉平滑肌细胞（CASMCs）为模型，利用Lonza核转染等技术，研究了Ⅱ型糖尿病患者的动脉粥样硬化斑块忠SirT1对TIMP3的表达调控作用。实验结果显示在CASMCs中，抑制SirT1的活性会下调TIMP3的表达，同时SirT1的过表达会上调TIMP3的表达。

  Serve Olieslagers[2]等想研究TGF-β1信号通路怎样调节单核细胞的迁移能力，糖尿病心血管病危险因子是否会影响单核细胞的迁移能力。他们以人单核细胞为模型，利用siRNA基因敲除技术（Lonza核转染系统），对SMAD2和SMAD3进行敲除，电转染后细胞成活率>90%。实验结果显示，SMAD2和SMAD3不会对TGF-β1介导的单核细胞迁移能力产生影响。

  Suseela Srinivasan[3]等以小鼠原代CD4+T细胞为模型，利用Lonza核转染（siRNA）等技术，研究S1P能否通过调节HIF1α I.1和CD69的表达从而降低I型糖尿病人CD4+T细胞的活性，进而发掘S1P降低I糖尿病人并发炎症的治疗潜能。实验结果显示S1P能够显著性的上调HIF1αI.1，从而使IFN-和CD69的表达下调，进行降低I型糖尿病人CD4+T细胞的活性，具有一定的潜在治疗能力。

  Peroxisome proliferator-activated receptor-δ(PPARδ) agonists在糖尿病患者中能够提高细胞对胰岛素的敏感性。GW1516作为PPARδ活化剂可通过PI3K/Akt信号通路增强血管生成的能力，具有治疗糖尿病的潜在能力。Tian[4]等以小鼠原代主动脉内皮细胞为模型，利用Lonza核转染（转染效率70%）等技术，研究Akt信号通路与GW1516的相互作用关系。实验结果显示Akt活性的受抑制会降低GW1516在小鼠原代主动脉内皮细胞的活化作用。

  INS基因（Preproinsulin gene）在某些位点上的隐性突变是导致新生儿糖尿病的重要原因。Intza Garin[5]等以Hela细胞为模型，利用Lonza核转染技术，将2个重要的INF隐性突变基因转入Hela细胞，研究突变基因对胰岛素的合成是否产生影响。实验结果显示，和转入正常INF基因的细胞相比，转入隐性突变基因的细胞中的胰岛素含量分别减少了86%和79%。所以Intza Garin等认为具有隐性突变的INF基因的个体会减少胰岛素的合成，从而诱发新生儿短暂性糖尿病。

  为了研究胰岛素样生长因子1受体（IGF1Rs）表达量变化是否会影响细胞对胰岛素的敏感性，Niels Engberding[6]等以斯普拉格-杜勒鼠原代血管平滑肌细胞（VSMCs）为模型，利用腺病毒感染和Lonza核转染技术（RNAi）分别对IGF1Rs进行过表达和下调表达，研究IGF1Rs表达量变化对VSMCs的胰岛素敏感性产生的影响。实验结果显示IGF1Rs的过表达会降低胰岛素介导的Akt磷酸化的水平；IGF1Rs的下调表达会增强胰岛素介导的IRβ的磷酸化水平，会增强细胞对葡萄糖的摄取能力。

  Jamie Cantrell Stanford[7]等以MIN6细胞系为模型，利用siRNA技术（Lonza核转染系统）分别对神经鞘氨醇激酶2（SphK2）和Sgpp1（S1P磷酸酶）进行基因敲除，以此研究鞘氨醇激酶（S1P）对葡萄糖刺激的胰岛素分泌过程的调控作用。实验结果表明S1P在葡萄糖刺激的胰岛素分泌过程起到非常关键的调控作用。

  在上述提到的糖尿病研究中，科学家都选择Lonza核转染系统作为其细胞转染方法，并取得了满意的实验效果，发表了高水平的研究论文。可见在糖尿病研究领域，Lonza核转染技术是一个被广泛使用的、值得信赖的细胞电转染技术，其为实验的顺利进行立下了汗马功劳。

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  Lonza Nucleofector™技术是Lonza公司的**创新技术，该技术利用传统的电穿孔技术配合高效率细胞转染液，通过预置的优化好的转染程序，直接将外源物质导入目标细胞的细胞质和细胞核中。与传统的转染技术相比，对于原代细胞、干细胞以及难转染的细胞系等哺乳动物细胞，NucleofectorTM技术的转染效率、细胞成活率更高，*高转染效率可达99%。*后，附上糖尿病研究中常用的细胞在Lonza核转染系统中的转染效率分布图[8]。

  图1 糖尿病研究中常用的细胞在Lonza核转染系统中的转染效率

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[1] Marina Cardellini, Rossella Menghini, et.al. TIMP3 Is Reduced in Atherosclerotic Plaques From Subjects With Type 2 Diabetes and Increased by SirT1.Diabetes.

[2] Serve Olieslagers, Evangelia Pardali, et al. TGF-b1/ALK5-induced monocyte migration involves PI3K and p38 pathways and is not negatively affected by diabetes mellitus. Cardiovascular Research.

[3] Suseela Srinivasan, David T. Bolick, et al. Sphingosine-1-Phosphate Reduces CD4+ T-Cell Activationin Type 1 Diabetes Through Regulation of Hypoxia-Inducible Factor Short Isoform I.1 and CD69.Diabetes.

[4] Tian Yuxiao, Wong Wingtak, et al. PPARδActivation Protects Endothelial Function in Diabetic Mice. Diabetes.

[5] Intza Garin, Emma L.Edghill, et al. Recessive mutations in the INS gene result in neonatal diabetes through reduced insulin biosynthesis. PNAS.

[6] Niels Engberding, Alejandra San Martín, et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Receptor Expression Masksthe Antiinflammatory and Glucose Uptake Capacity of Insulin in Vascular Smooth Muscle Cells. Arterioscler Thromb Vasc Bio.

[7] Jamie Cantrell Stanford, Andrew J. Morris, et al. Sphingosine 1-Phosphate (S1P) Regulates Glucose-stimulated Insulin Secretion in Pancreatic Beta Cells. Journal of Biological Chemistry.

[8] http://bio.lonza.com/6.html