Science突破性成果：鸟瞰细胞RNA

　　

生物通报道  如同在房地产中一样，在生物学中位置也很重要。活化基因的mRNAs战略性定位在整个活体组织中，它们的位置往往帮助调控了细胞和组织的生长及发育方式。然而为了同时分析许多的mRNAs，科学学家们不得不将细胞碾磨成浆，这使得他们没有好的办法精确确定这些mRNAs在细胞内的定位。

现在，哈佛大学Wyss生物启发工程研究所和哈佛医学院的一个研究小组，与Allen脑科学研究所展开协作开发了一种新方法，使得科学家们能够在完整细胞中同时确定数以千计mRNAs和其他类型RNAs的定位——测定碱基序列来鉴别它们，并揭示出它们在做什么。

研究人员将这种方法命名为荧光原位RNA测序(FISSEQ)，其有可能促成早期癌症诊断揭示出看似健康组织中驱动癌症的分子改变。并有可能追踪癌症突变以及它们对于现代靶向疗法的反应，并揭示出一些更安全、有效的治疗靶点。

该方法还有可能帮助生物学家们了解胚胎发育过程中组织的微妙变化——甚至帮助绘制出人类大脑神经元迷宫图谱。研究人员将这一方法在线发表在《科学》（Science）杂志上。

哈佛医学院遗传学教授、Wyss研究所核心成员George Church博士说：“通过全面检测细胞内的基因表达，我们能够指出在诸如大脑一类的复杂组织中现在看不到的许多重要差异。这将有助于我们了解组织的形成以及在健康和疾病状态中的功能机制。”

锁定RNAs

在特定的时间健康人类细胞通常会将它们2万个基因中近半数的基因开启，它们仔细地选择这些基因生成所需的细胞反应。此外，细胞还可以上调或下调基因表达，生成少数到数千个基因mRNAs。

但同时精确指出所有这些mRNAs的细胞位置却是一件难办的事情。

Church和Wys研究所及哈佛医学院研究人员Je Hyuk Lee博士迎接了这一挑战。此外，他们还想同时确定这些RNAs的序列，由此鉴别它们并揭示它们的功能。

Lee和同事们首先采用化学方法处理组织将细胞中数千的RNAs进行固定。随后，他们利用一些酶将这些RNAs复制成DNA拷贝，然后将这些拷贝进行多次复制，生成一个固定在同一点的复制DNA小球。

他们曾设法同时固定和复制了成千上万的细胞RNAs。但这些RNAs非常紧密地包装在细胞内，显微镜和照相机都无法将单个复制DNA球的闪光与邻近的区分开来。

一种RNA成像新方法

为了解决这一问题，研究人员开发了一种非常规方法显影细胞内的微小物体。它像城市邮政系统一样运作。如果邮件管理员试图通过颜色来鉴别她所在城市中的每个家庭，随着新的家庭建立起来她将很快用完颜色，使得邮件无法投递。相反，邮件管理员是通过分配给它一个独特的地址从而追踪每个家庭。

研究人员意识到他们可以给细胞内的每个RNA分配一个独特的地址：RNA自身分子中的碱基序列。他们认为采用类似新一代DNA测序的方法他们可以读取这一地址。

在新一代测序中，科学家们碾磨组织，提取其DNA，让DNA断裂成小片段，然后稀释这些片段使得每个DNA片段都能附着到载玻片单个位点上。他们利用一些酶和4种不同的荧光染料——每种染料代表一种碱基——使得DNA闪现一连串颜色，揭示它的序列。

采用类似的方法，科学家们尝试在细胞中固定RNA,生成包含许多复制DNA的小球，然后采用新一代DNA测序，因此它能够在固定细胞中起作用。4种闪光颜色可揭示每种复制DNA的碱基序列，告诉他们匹配RNA的碱基序列。这些序列理论上可提供无限数量的独特地址——一个原始RNA一个地址。

起初科学家们难以显影整个组织景观仍在视野范围内时远距离单个复制DNA球的闪光。他们通过在特定时间选择性开启部分闪光点取得了成功，因此可以区分整个细胞区域的单个复制DNA闪光球。

这一策略只在他们能够读取到足够多的碱基序列提供一个独特的地址时才会起作用。最初，他们能够确定的复制DNA碱基不超过6个，不能提供足够多独特的地址鉴别人类基因组中的单个基因。这时哈佛医学院的研究生Evan Daugharthy加入进来。

Fisseq起作用

Daugharthy首先设计了一种算法利用人类基因组中已知的基因序列来定位复制DNA序列。将不能对应真正基因的闪光从图像中删除。

随后Daugharthy利用了一种商业化DNA测序试剂盒，这使得研究小组能够测序30个碱基，足够给每种复制DNA提供一个独特的地址。以这种方式，研究小组生成了对应人类基因组中每个基因的RNA序列和位置的合成图像。

Lee、 Daugharthy和同事们随后对这种方法进行测试，检测了当皮肤细胞在培养皿中增殖、迁移并愈合模拟伤口时开启的基因。相比于边缘线上静坐的邻近细胞，生长到创伤处的细胞有12种基因表达改变。相似的试验可以确定病变组织的一些新标记物或靶向分子治疗的一些新靶点。

Wyss研究所主任Don Ingber,说：“George研究小组完成了一个技术杰作。通过难以置信地确定微妙但极其重要的基因表达改变，精确确定它们的细胞内定位，他们帮助打开了细胞诊断学新时代的大门。”

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Highly Multiplexed Subcellular RNA Sequencing in Situ

Understanding the spatial organization of gene expression with single-nucleotide resolution requires localizing the sequences of expressed RNA transcripts within a cell in situ. Here, we describe fluorescent in situ RNA sequencing (FISSEQ), in which stably cross-linked cDNA amplicons are sequenced within a biological sample. Using 30-base reads from 8742 genes in situ, we examined RNA expression and localization in human primary fibroblasts with a simulated wound-healing assay. FISSEQ is compatible with tissue sections and whole-mount embryos and reduces the limitations of optical resolution and noisy signals on single-molecule detection. Our platform enables massively parallel detection of genetic elements, including gene transcripts and molecular barcodes, and can be used to investigate cellular phenotype, gene regulation, and environment in situ.