NGS文库制备的方法比较[心得点评]

近年来，新一代测序（NGS）技术的应用日益广泛。随着测序技术的不断改进，制备核酸和构建NGS文库的方法也在改进。对于各种文库制备方法，我们该如何选择？近日，美国斯克里普斯研究所的研究人员在《Biotechniques》上发表文章，比较了各种文库制备策略。

总的来说，在NGS分析之前，制备RNA或DNA的主要步骤包括：片段化和/或筛分指定长度的目标序列；将目标片段转化成双链DNA；在片段末端连上寡核苷酸接头；以及定量最终的文库。

DNA片段的大小是NGS文库构建的主要因素。DNA片段化主要是通过物理方法（如超声破碎）或酶学方法（即非特异的核酸内切酶处理）来实现的。作者将这两种方法进行了比较，发现它们都很有效。不过，与物理方法相比，酶学方法（Fragmentase）产生更多人为的插入缺失。作者还提到了Illumina的Nextera技术，认为它能够减少样品处理并节约时间。

作者提到，在制备DNA样品的文库时，应考虑几点，包括起始材料的量以及测序应用。若基因组的GC含量较高或较低，文库制备有可能会出现偏向。此时应精心选择PCR扩增的酶、条件以及缓冲液，来解决这些问题。

目前有多家公司提供制备DNA测序文库的试剂盒。竞争使得价格稳步下降，质量不断上升。这些试剂盒可从微克至皮克级的起始材料开始制备文库。不过，大家应该记住这一点，起始材料越多，意味着扩增越少，文库复杂性越好。

对于RNA测序实验，作者认为，在决定文库制备的方法之前应考虑实验的主要目的。如果目的是发现复杂和整体的转录事件，那么文库应捕获整个转录组，包括编码、非编码和基因间RNA，尽可能完整。然而，在很多情况下，人们的目的只是研究翻译成蛋白的编码转录本。此外，有些研究的目的是分析小RNA，主要是miRNA，或snoRNA、piRNA等。作者列出了各个实验的选择指南。

作者还提到，制备测序文库时的主要目标是产生尽可能少的偏向（bias）。偏向可被定义为因实验设计而产生的数据系统失真。既然不可能消除所有来院的实验偏向，那么我们至少要了解，偏向发生在哪里，并采取一切可行的步骤来尽量减少；注意实验设计，让不可能消除的偏向对最终分析的影响最小。

此外，作者还详细介绍了各个NGS应用的样品制备方法，包括靶向测序、mate pair测序、ChIP-Seq、RIP-Seq以及Methylseq，并讨论了从单细胞制备文库的方法。（生物通 薄荷）

原文检索

Library construction for next-generation sequencing: Overviews and challenges

BioTechniques, Vol. 56, No. 2, February 2014, pp. 61–77