苏州大学利用TALEN技术研究斑马鱼生物钟

2014年12月28日，苏州大学基础医学与生物科学学院王晗课题组，在国际著名学术期刊《Journal of Biological Chemistry》发表一项最新研究成果。 在这项研究中，研究人员利用TALEN技术，成功制备了两种斑马鱼per2无效突变体，阐明了Per2在斑马鱼生物钟中的基本功能，并为PER2在脊椎动物昼夜节律系统中的积极作用，提供了关键的证据。

　　

生物通报道：2014年12月28日，苏州大学基础医学与生物科学学院王晗课题组，在国际著名学术期刊《Journal of Biological Chemistry》发表一项最新研究成果，题为“The zebrafish Period2 protein positively regulates the circadian clock through mediation of RAR-related orphan receptor alpha (Rorα)”。 在这项研究中，研究人员利用TALEN技术，成功制备了两种斑马鱼per2无效突变体，阐明了Per2在斑马鱼生物钟中的基本功能，并为PER2在脊椎动物昼夜节律系统中的积极作用，提供了关键的证据。

本文通讯作者为苏州大学基础医学与生物科学学院博士生导师、特聘教授王晗，其本科毕业于安徽大学，获中科院硕士学位，美国韦恩州立大学博士学位，曾在美国佐治亚医学院、俄勒冈大学和俄克拉荷马大学从事博士后研究和助理教授，2009年至今，任苏州大学医学部基础医学与生物科学学院特聘教授、国家重大研究计划项目首席科学家。主要研究方向为生物钟分子遗传和基因组调控机制、生物钟对生殖和发育的影响、生物钟进化的分子遗传和基因组机制等领域，曾在Nature  Genetics、Development、Evolution和Journal of Molecular Evolution等杂志发表40余篇学术论文。

生物钟，从生物对地球上光/暗周期长期和持久的适应进化而来，可以被当地环境因素（例如光、甚至食物）复位和同步，可以在大约24小时的一段时间内调节行为和生理学。在几种生物（包括蓝藻、粗糙脉孢菌、黑腹果蝇和小鼠）中进行的一系列遗传和生化研究，已经确定了昼夜节律调控的分子遗传机制。延伸阅读：科学家发现生物钟的最后一块拼图

斑马鱼（Danio rerio）是研究生物钟的一种极好模型，具有与果蝇和哺乳动物类似的昼夜节律调控组件。光照和温度是斑马鱼关键的夹带生物钟因素，特别是，斑马鱼外周组织可以直接响应光信号，产生节律性。

两个光受体（Tmt视蛋白和Opsin4.1），已被证明对于斑马鱼外周生物钟的光夹带至关重要。此外，光可以调控生物钟，对斑马鱼的细胞周期和DNA损伤修复产生影响。尽管转录/翻译为基础的回路也被认为在斑马鱼中起作用，但是斑马鱼和哺乳动物之间的昼夜节律调控存在显著的差异。

哺乳动物Period2作为昼夜节律钟的一个典型组分，在昼夜节律、睡眠、代谢和致癌作用中起着重要的作用。在人类当中，一个PER2错义突变通过CK1δ废止磷酸化作用，并导致家族性睡眠期综合征（FASPS）。小鼠Per2是一个光反应基因，其在视交叉上核（SCN）中的昼夜节律时相和表达振幅，可根据不同的光/暗周期而有所改变。

斑马鱼Per2也是一个光调节基因，在恒定黑暗条件下它的表达显著减弱。利用转基因鱼和稳定转染的细胞系分析方法，研究人员确定了一种由Per2中D-baox和E-box基序组成的光响应模板（LRM）。此外，斑马鱼per2是生物钟控制的aanat2表达、编码褪黑素合成限速酶所必需的。

尽管所有这些重要的研究进展都与斑马鱼per2有关，但是斑马鱼per2没有酶原稳定的遗传突变，这对于确定其在斑马鱼生物钟调控以及其他生命过程中的作用非常关键。

最近，基因组编辑工具锌指核酸酶（ZFN）、转录激活样效应物核酸酶（TALEN）和CRISPR/Cas9已被发展用以产生位点特异性的DNA双链断裂（DSBs），可触发内源性非同源末端连接（NHEJ）DNA修复途径，以诱导许多物种（包括斑马鱼）中靶基因的插入缺失突变。

在这项研究中，研究人员利用TALEN成功制备了两种per2无效突变体（null mutant；由于大片段插入、缺失或重排而导致基因产物完全无效）斑马鱼。运动实验表明，Per2突变体斑马鱼在LD（光-暗）条件下和DD（持续黑暗）条件下2小时的相位延迟，表现出活动减少，实时定量PCR分析表明，在per2突变斑马鱼中，cry1aa、cry1ba、cry1bb和aanat2基因表达上调，但是per1b、per3和bmal1b基因表达下调，从而表明Per2对于斑马鱼生物钟是必不可少的。荧光素酶报告基因分析表明，Per2可通过E-box抑制aanat2表达，并通过RORE增强bmal1b表达，从而说明Per2在斑马鱼生物钟中起着双重作用。细胞转染和co-IP试验表明，Per2可通过与orphan核受体Rorα结合，增强bmal1b的表达。

该研究还确定，PER2在Bmal1表达中的积极作用，从斑马鱼到小鼠都是保守的，差异在于，斑马鱼的Per2可通过与Rorα（而不是Rev-erbα）结合增强bmal1b表达，而小鼠PER2对Baml1表达的增强作用，仍然需要RORα介导，即使它与REV-ERBα（而不是RORα）结合。此外，斑马鱼Per2似乎在许多外周器官中有特异性的调控作用。

总而言之，这些结果有助于阐明Per2在斑马鱼生物钟中的基本功能，并为PER2在脊椎动物昼夜节律系统中的积极作用，提供了关键的证据。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
The zebrafish Period2 protein positively regulates the circadian clock through mediation of RAR-related orphan receptor alpha (Rorα)
Abstract: We report characterization of a null mutant for zebrafish circadian clock gene period2 (per2) generated by Transcription Activator-Like Effector Nuclease (TALEN) and a positive role of PER2 in vertebrate circadian regulation. Locomotor experiments showed that per2 mutant zebrafish display reduced activities under LD (light-dark) and 2-hour phase delay under DD (constant darkness), and quantitative real-time PCR analyses showed up-regulation of cry1aa, cry1ba, cry1bb and aanat2 but down-regulation of per1b, per3 and bmal1b in per2 mutant zebrafish; suggesting that Per2 is essential for the zebrafish circadian clock. Luciferase reporter assays demonstrated that Per2 represses aanat2 expression through E-box and enhances bmal1b expression through RORE, implicating that Per2 plays dual roles in the zebrafish circadian clock. Cell transfection and co-IP assays revealed that Per2 enhances bmal1b expression through binding to orphan nuclear receptor Rorα. The enhancing effect of mouse PER2 on Bmal1 transcription is also mediated by RORα even though it binds to REV-ERBα. Moreover, zebrafish Per2 also appears to have tissue-specific regulatory roles in numerous peripheral organs. These findings help define the Per2's essential functions in the zebrafish circadian clock, and in particular provide strong evidence for a positive role of PER2 in the vertebrate circadian system.