癌症研究概览13：技术因素

癌症研究中的实验设计具有一些独特的挑战。典型的肿瘤样品包含两个基因组：遗传自父母的生殖细胞系和疾病发展过程中积累的体细胞突变。样品中肿瘤细胞的比例介于10-100%之间。肿瘤基因组也是非常动态的，可快速积累de novo突变。因此，肿瘤可能包含几种克隆类型。幸运的是，Illumina的测序技术可无前提假设、高分辨率地分析基因组。良好的实验设计可进一步优化技术能力并产生更多可解释的可靠数据。这一部分将着重强调生物学研究的独特之处以及研究人员在设计实验时需要注意的事项。

FFPE样品

在临床背景下，标本是以福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的形式保存的。它们产生了比较短的DNA片段，但仍可通过新一代测序分析并得到良好的结果。

下表例举了Illumina测序技术完成FFPE样品测序并在不同研究中的成功应用：

少量样品

肿瘤通常包含几种克隆群体，它们反映了突变的不断积累。单细胞基因组学方法能够分辨这些复杂的细胞混合物，而整个组织的分子生物学分析只能反映群体的平均信号或主要克隆的信号，后者可能并不代表肿瘤中最致命的克隆。

单细胞基因组学方法的临床价值在于对临床样品中的稀有癌细胞进行序列分析，监控并检测可能耐受化疗的稀有克隆。这些应用有可能改善肿瘤学的三个重要主题：检测、发展和治疗效力的预测。

Navin, N. an d Hicks J. (2011) Future medical applications of single-cell sequencing in cancer.Genome Med 3:31

在这篇综述中，作者概述了目前分离单细胞和分析它们的基因组图谱的方法以及正在开发的方法，特别着重于基因组拷贝数的分析。以Illumina HiSeq 2000的现有通量，在单张流动槽（flow cell)的单个通道中最多可对25个单细胞进行测序，从而实现单张flow cell运行200个单细胞样品的序列分析。

Navin, N., Kendall J., Troge J., Andrews P., Rodgers L., et al. (2011) Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature 472: 90 - 94

在这篇文章中，作者利用细胞核流式分选、全基因组扩增和SBS来准确定量单个细胞核中的基因拷贝数。对两例乳腺癌患者的100个单细胞的分析显示出三种不同的克隆亚群。这项研究表明，通过SBS可以从单细胞中获得可靠的高分辨率拷贝数图谱。在分析同一个癌症的多个细胞时，有可能推断出癌症的进化和扩散情况。值得注意的是，作者还发现了大量的假二倍体细胞，而之前用其他方法都未检测到。

Illumina测序技术：GAIIx 全基 因组扩增子测序，76 bp single reads，9M reads per cell

组织培养物

建立肿瘤细胞系是常规的研究方法，但这些细胞系能在多大程度上代表原发肿瘤仍无法确定。天生不稳定的细胞系经过长时间培养，会积累不少突变；而培养过程中另一个瓶颈是暂时性的细胞群体减少，该过程会大大加速突变的累积。（全文完）

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