Cell子刊封面：用CRISPR技术靶向人类干细胞

　　

生物通报道  来自哈佛干细胞研究所(HSCI)、麻省总医院(MGH)和波士顿儿童医院(BCH)的研究人员，第一次利用一种相对较新的基因编辑技术，构建出了一种能够阻断HIV侵袭和破坏患者免疫系统的有效治疗方法。

这是首次报道，一个研究小组利用CRISPR Cas技术有效及精确地编辑删除了直接从患者处采集的细胞——人类造血干细胞和T细胞中的临床相关基因。

尽管研究人员相信，在五年内这种新方法有可能准备好进入人类安全试验，他们自己也提出了三个需谨慎的方面：

第一个、也是最显著的一个方面是，它们有可能会遭遇意想不到的并发症；第二是，艾滋病毒/艾滋病传染病史上有着一些“治愈”的例子，但最终被证明并未治愈；最后，即便这种方法能够很好地起作用，仍需要进一步的开发才能应用到世界上受到艾滋病最沉重打击的地区。

由哈佛大学干细胞和再生生物学系副教授Chad Cowan及Derrick Rossi领导的这项研究工作，被选为了最新一期《细胞干细胞》（Cell stem cell）杂志上封面文章。

HIV专门针对的是免疫系统的一个主要的组成细胞——T细胞，其通过一种叫做CCR5的基因受体进入到T细胞中。一旦进入，HIV会复制并杀死宿主细胞，让患者陷入各种机会性感染之中。

利用CRISPR Cas基因编辑技术，Cowan和Rossi研究小组敲除了造血干细胞的CCR5受体，并证实这样可导致分化血细胞缺失CCR5。理论上，可通过骨髓移植将这样的接受基因编辑的干细胞导入到HIV患者体内，来引发抗HIV免疫系统。

Cowan 说：“我们证实可以非常有效地敲除CCR5，其细胞仍然具有功能，我们做得很好，极深度测序分析结果显示没有任何不必要的突变，因此它看起来是安全的。但显然还有更多的工作要做。”

“下一阶段是要与麻省总医院Ragon研究所合作开展动物实验。那里有极好的小鼠模型，你可以给予其人类免疫系统，然后感染HIV。我们可以给予小鼠人类细胞，看看它们是否会免于HIV感染。一旦这些研究完成，并且能够取得成功，没有并发症出现，下一步将会向美国食品和药物管理局正式申请启动I期人类试验，专门设计测试新疗法的安全性。但现在预测还有多久有可能开始这样的试验还为时过早，”Cowan说。

哈佛干细胞研究所联合主任、麻省总医院再生医学中心主任、血液病学家/肿瘤学家David Scadden，评价这一新的研究工作是“朝着编辑删除掉使得人类细胞易受到HIV感染的东西迈出的重要的第一步。其让个体自身的免疫细胞在不受HIV的影响下来攻击它——这一想法成为了可能。由于是在干细胞中完成，这可以导致整个免疫系统持久地瞄准病毒。这是一个强大的概念。”
 
Scadden说：“这是我们必须一路追逐直至进入临床的工作。并且还需要一些相关的研究来提高干细胞移植的安全性和方便性，将这项研究工作带到广泛的患者中去。”

这项工作尤为具有前景之处在于，它有可能创造了一种方法为大量的患者做到Timothy Ray Brown身上发生的事情。Brown是一位同时罹患HIV-AIDS和白血病的柏林患者。医生将从一名因罕见的遗传缺陷而缺失CCR5受体的个体处采集的骨髓移植给了Brown。据报道自从接受移植以来，在6年的时间里Brown体内都没有HIV，他被视作为有史以来唯一获得“治愈”艾滋病患者。如果取得成功，Cowan和Rossi提出的基因治疗有可能做到相同的事情。

Cowan说，实验是在哈佛干细胞研究所完成。当时这一干细胞生物学家研究小组才“刚刚开始玩CRISPR系统，我和造血干细胞专家Derrick交谈后，我们决定我们应该试试这个。”因此Cowan和他的研究小组在T细胞中完成了基因编辑，而Rossi的研究小组则将焦点放在了造血干细胞上。

“CRISPR在近两年被大量地使用，一个接一个的报道指出在A细胞系或B细胞系中具有高效率（延伸阅读：Nature：CRISPR技术在癌症领域大放异彩 ）。却没有人报道过在原代造血干细胞中CRISPR的效率或效用。但是大多数研究者们都同意，血液将是基因编辑疗法靶向的第一个组织。你可以从患者那里取得造血干细胞，编辑它们，然后再移植回去。”

在他们的论文中，Rossi和Cowan显示他们可以有效地、可预测性地，精确编辑删除T细胞的β2M以及造血干/祖细胞(HSPCs)的CCR5。他们进一步证实，编辑的HSPCs可以继续生成正常的血细胞和免疫细胞组合。

他们二人还关注了CRISPR的精确性。

Rossi说：“有一些论文表明CRISPR具有高脱靶活性。我们决定在6种不同的实验条件下在原代造血干细胞中测试它的精确度。”

研究小组对尝试编辑删除HSPCs中的CCR5时有可能混入CRISPR的一些基因组位点进行了深度测序。他们发现系统生成异常切割的风险实际上为零。同时，预期的CCR5打靶非常的高。“这些结果提供了临床前证据证实，当在造血干细胞中谨慎使用1.0版本的CRISPR时，将很快可以准备好应用于患者，”Rossi说。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文索引：

Efficient Ablation of Genes in Human Hematopoietic Stem and Effector Cells using CRISPR/Cas9

Genome editing via CRISPR/Cas9 has rapidly become the tool of choice by virtue of its efficacy and ease of use. However, CRISPR/Cas9-mediated genome editing in clinically relevant human somatic cells remains untested. Here, we report CRISPR/Cas9 targeting of two clinically relevant genes, B2M and CCR5, in primary human CD4+ T cells and CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Use of single RNA guides led to highly efficient mutagenesis in HSPCs but not in T cells. A dual guide approach improved gene deletion efficacy in both cell types. HSPCs that had undergone genome editing with CRISPR/Cas9 retained multilineage potential. We examined predicted on- and off-target mutations via target capture sequencing in HSPCs and observed low levels of off-target mutagenesis at only one site. These results demonstrate that CRISPR/Cas9 can efficiently ablate genes in HSPCs with minimal off-target mutagenesis, which could have broad applicability for hematopoietic cell-based therapy.