检测简单重复序列变异的新方法

　　

生物通报道：紧密的DNA中存在某些重复简单序列，可能与疾病有关，但是，这些所谓的卫星DNA受到的关注相对较少。最近，来自德州农工大学（Texas A&M University）的研究人员，描述了一种基于实时定量PCR的方法，来量化简单重复的微卫星序列，从而使科学家们能够描述可能会引起DNA序列持久改变的情况。阅读更多……

很长一段时间以来，Keith Maggert和他的同事猜测，很大一部分的基因组是高度可变的，身体中没有两个细胞在基因上是相同的。他在德州农工大学实验室正在进行的研究显示，基因组似乎改变的有多容易。暴饮暴食、压力和突变，似乎都会对基因组产生永久性的变化。Maggert解释说：“饮食是致命疾病的最大因素，但是关于其中的原因，也有许多争论。我们有自己的想法，其中一个因素是，不良的饮食习惯会改变基因组的稳定性，使你的染色体发生变化。”

根据Maggert介绍，大量的遗传变异定位在基因组中的重复部分。人们已经日益认识到，存在于紧密形式DNA（称为异染色质）中的某些重复简单序列，可能有疾病有关。这些所谓的卫星DNA包括近一半的真核生物基因组，异染色质是人类基因组和大多数模式生物基因组的一个重要组成部分。虽然异染色质被认为主要是非编码的，但是很显然，它在染色体结构和基因调控中起着重要的作用。

尽管有其功能显著性的证据，一些异染色质中的重复序列，受到的关注相对较少，部分是因为，我们很难使用标准的分子工具来理解这些序列对异染色质结构的影响。因此，高度重复的异染色质卫星序列的机制理解，已经远远落后于对常染色质序列功能的复杂理解。

为了解决这一知识空缺，Maggert和研究生John Aldrich开发了一种基于实时定量PCR方法，来量化简单重复卫星序列，并用这一技术来表征果蝇的异染色质Y染色体。相关研究结果发表在最近的《PLOS ONE》杂志，这种简单方法可让研究人员能够调查重复序列的动态性，表征可能引起DNA序列持久改变的情况。

Maggert说：“对于遗传学和疾病之间的关系以及寻找个性化疗法，有如此多的谈论。然而，这个话题是不完整的，除非生物学家能够看到整个基因组。我们仍然做不到，但是至少现在我们更近了一步。”

量化拷贝数
目前存在一些用于确定卫星DNA拷贝数的方法。这些方法包括，使用荧光原位杂交（FISH）定量、杂交印迹和新一代测序。在这项新研究中，Aldrich和Maggert采用一种实时定量的PCR分析，最初这种方法设计用于量化端粒重复拷贝数。端粒是每条染色单体末端重复核苷酸序列的区域，因为端粒DNA和异染色质卫星可造成相同的问题（即，两者都包含短的、均匀的、高拷贝数的序列），作者认为，该方法可能也适用于异染色质卫星。

Maggert解释说：“它的新颖之处在于，它应用于基因组中的高度重复部分。这更多的是一个概念上的进步，如何应用有意设计的错配引物，来优先进行PCR扩增，从而量化高度重复的DNA。这不是一种新的测序方法，只是一种方法，让引物特异于固有的非特异性冗余序列。”

Aldrich和Maggert采用自然生态变异和突变分析，来验证这种方法，并在三种不同地理来源、野外捕获的果蝇中所提取的Y染色体中发现卫星拷贝数的变异。使用这种新方法，他们还发现，长期暴露于影响异染色质形成和基因组稳定性的一个突变，会导致卫星拷贝数的可测量变化，这表明卫星拷贝数稳定性是由染色质因素调节的。

根据Daniel Barbash（他在康奈尔大学研究了果蝇的基因组进化）介绍，这一技术更容易、更便宜，可能比杂交为基础的方法更准确。他说：“这种方法提供了一种新的方式，抽样检查大量种群和物种，寻找简单重复序列的变异，从而为进行功能分析提供新材料。”

令人兴奋的阶段
正如作者指出的，这种分析方法的迅速、灵活和成本效益，使其对大多数研究人员非常有用，即使那些缺乏更昂贵方法的研究人员，如新一代测序。它能够在不到一天的时间内处理活体生物，产生数据。此外，该方法在DNA浓度或提取波动中表现非常稳定，对卫星重复拷贝数的小变化都很敏感。这种方法，能够使用只不过1纳克的基因组DNA进行分析，从而能够对个体、旧样品或解剖组织的卫星拷贝数进行独立评估，远远低于Southern杂交分析的可检测极限。

一个潜在的缺点是，该方法确定的是相对拷贝数，而不是绝对拷贝数。Barbash说：“也许进一步发展可能包括已知的内部标准，允许绝对估测。”Maggert解释说，然而，有机体之间的卫星拷贝数对比是可行的，可让研究人员确定是否突变或治疗会导致拷贝数的变化。他说：“几乎每个人都能使用它，可能最适合用于诊断目的，例如检测组织活检。”

最后，这种技术可让科学家们解决一些关于基因组的重要问题。Maggert说：“我们绝对还不能确定有多少变化，是什么引起了所有变化，所有的后果是什么。但是，这意味着，这一技术马上就会进入一个令人兴奋的阶段。”

（生物通：王英）

延伸阅读：用新一代测序寻找罕见变异 需谨慎

生物通推荐原文：
1. Aldrich JC, Maggert KA (2014) Simple Quantitative PCR Approach to Reveal Naturally Occurring and Mutation-Induced Repetitive Sequence Variation on the Drosophila Y Chromosome. PLoS ONE.9(10): e109906. doi:10.1371/journal.pone.0109906

2. Cawthon RM (2002) Telomere measurement by quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 30: e47.

3. Cawthon RM (2009) Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative PCR method. Nucleic Acids Res. 37: e21.