PCR替代技术，RPA全攻略之疑难解答

【字体：大中小】 时间：2014年11月04日 来源：生物通

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　　重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（由英国公司TwistDx Inc开发）。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。之前我们简单介绍了RPA技术的原理和特色，现在你一定对这个技术产生了不少疑问。

生物通报道：重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（由英国公司TwistDx Inc开发）。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

之前我们简单介绍了RPA技术的原理和特色，现在你一定对这个技术产生了不少疑问。（延伸阅读：核酸检测的一场革命，可替代PCR的犀利技术）

RPA反应需要在怎样的温度下进行？

标准TwistAmp®试剂盒的运行温度在37°C - 42°C之间。温度超过42°C会使酶的活性受到影响。RPA反应在低于37°C的条件下也能进行，不过TwistAmp®试剂盒已经针对反应速度进行了优化，不一定支持超出范围的温度条件。为了获得更好的效果，TwistDx公司推荐用户在40°C下使用于逆转录试剂盒。

RPA反应能实现多重化么？

可以。RPA技术支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过，多重化的引物组合需要精心设计，以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是，RPA反应的引物总量（nmol）最好不要超标太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物，就应该控制不同引物的量。另外，我们应当事先考虑好检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光团的兼容性。

RPA反应需要在特殊仪器上进行么？

不需要。对TwistAmp®基础试剂盒和nfo试剂盒而言，只要温度能控制在37-42°C之间就行。进行实时监控的体系（如TwistAmp® exo试剂盒），需要能够激发和检测荧光团的恒温装置，比如酶标仪或实时检测的热循环仪。

RPA反应能对模板进行定量么？

可以。扩增子达到可检出水平的时间，依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多，扩增子就越快达到可检出水平。不过，这种定量需要精心的实验安排，确保对照反应是同时开始的。举例来说，可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系，RPA反应就会开始。

此外，较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度。

扩增产物能在琼脂糖凝胶上分析么？

可以，TwistAmp®基础反应、TwistAmp®nfo和TwistAmp® fpg都可以通过跑胶进行终点分析。不过TwistAmp® exo不行，因为该系统里的外切核酸酶会消化扩增子。

扩增反应能进行荧光终点分析么？

可以。这样比较的是反应开始时的荧光和反应结束时的荧光，荧光增强意味着发生了扩增。

RPA支持生物素或荧光标记的寡核苷酸么？

支持。在RPA反应中，连有生物素或荧光团的引物与未修饰的引物表现差不多。据悉还没有发现任何差异。

能用插入性染料实时监控RPA么？

可以。插入性染料可以在RPA反应中进行定量和监控。不过，这种染料可以结合任何双链DNA，会生成来自引物的假阳性信号。由于RPA扩增在常温下进行，这种噪音会比PCR严重一些。此外，不推荐把插入性染料用于TwistAmp® exo体系，因为体系中的核酸外切酶会在反应过程中切割扩增产物。

RPA试剂能制成master-mix么？

可以。在进行DNA检测时，可以把重悬缓冲液、引物和探针混合在一起，重悬冻干的RPA pellets。然后将不同DNA加入反应体系，最后用MgAc起始反应。在进行引物筛选时，可以用重悬缓冲液、模板DNA、探针和一个引物制成master-mix，将其分装到1.5 ml小管之后再分别加入不同的引物。注意：只有当两个引物都存在时，才能重悬冻干的RPA pellets，否则重组过程就会有偏向性。