哈佛华裔牛人Nature子刊发布基因组编辑新技术

　　

生物通报道  作为潜在的新一代治疗和研究工具，几乎没有什么生命科学技术比基因组编辑蛋白质更具发展前景——研究人员可通过编程这些分子来改变特定基因，以治疗或甚至治愈一些遗传性疾病。

可是，要将这些基因组编辑蛋白导入到细胞中，尤其是活体动物或人类患者体内，对于研究人员而言却仍是一个巨大的挑战。

通常，研究人员是将编码这些基因组编辑蛋白的DNA传送到细胞中，然后依赖细胞来生成相应的基因组编辑蛋白质。然而，许多的DNA传送策略并不能够应用于动物或人类患者。其他的一些DNA传送策略，例如通过感染病毒将DNA注入细胞中可以引发长期的复杂的安全问题，尤其在编辑人类基因组之时。

一项发表在10月30日《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上的新研究发现，相比于将编码基因组编辑蛋白的基因传送到细胞中，直接传送这些蛋白质有可能更具有前景。一类有可能已置于许多生物学家架子上的分子，可为这些基因组编辑蛋白打开大门。

论文的通讯作者是哈佛大学化学及化学生物学教授，霍华德休斯医学研究所研究员David R. Liu。据称这位教授是一位从来没有做过博士后的年轻教授，他早年毕业于哈佛大学，1999年在加州大学伯克利校区攻读博士学位，在Peter Schultz教授指导下从事核糖核酸研究，并自主首次开始活细胞遗传密码的研究。之后就被哈佛大学任命为助教授，2004年晋升为教授。Liu教授曾被麻省理工学院技术评论列入全球Top 100 青年发明家（35岁以下），“大众科学”亦将其列入全美Top10最具才气的青年科学家（延伸阅读：哈佛华裔牛人Nature子刊解析Cas9特异性 ）。

在David Liu以及研究组成员John Zuris及David Thompson的领导下，哈佛大学的研究人员小组开发出了一个利用商业化阳离子脂质（cationic lipid）的系统，其能够有效地将基因组编辑蛋白导入到细胞中，他们还证实了这一技术可用于修饰活体动物的基因。

David Liu解释说：“当前的遗传性疾病治疗药物不能解决疾病的根源。不同于传染性疾病，我们是通过杀死致病介质来进行治疗。针对由我们自身的基因突变所引起的疾病，必须要进入到细胞中，对我们的基因组实施手术来修正问题的根源。多亏了世界各地的科学家们近年来获得的一些新研究发现，我们现在拥有了可以实施这种手术的基因组编辑蛋白。但仍然面临着一个挑战：像几乎所有的蛋白质一样，这些蛋白无法自发地进入到细胞中。

“在这项研究中，我们描述了一种能够极其有效地将基因组编辑蛋白传送到细胞中去的新方法。我们观察到利用这一方法不仅可以在培养细胞中，还可在活体动物中实现高效的基因组修饰。”

尽管David Liu谨慎地表示，没有任何一个系统，包括新开发的这一系统是完全通用的传递方案，但他也表示相信将基因组编辑蛋白传送到细胞中，能够给罹患一系列疾病，包括某些眼、耳、肝脏、肌肉和血液疾病的患者带来希望。

研究人员瞄准的一种疾病是耳聋（deafness）。

与哈佛医学院的耳鼻喉科学副教授Zheng-Yi Chen以及马萨诸塞眼科及耳鼻喉专科医院的研究人员一起，David Liu和同事们利用这一新开发的系统修饰了小鼠内耳特化“毛细胞”中的基因。由环境或遗传因素导致的毛细胞受损是听力丧失的一个常见病因。

David Liu说，将蛋白质导入到细胞中去的一种常用策略是依赖于阳离子蛋白质。由于哺乳动物细胞的外部装饰着一些负电荷分子，正电荷蛋白可以附着负电荷分子上，由细胞将它们吞入到核内体( endosome )中。David Liu和学生们以往曾开发出这样的一种策略：利用正“超电荷”蛋白作为载体。

David Liu说：“几十年来众所周知，让货物从核内体脱离出来是一件非常困难的事情。蛋白质自发性脱离核内体的效率极低——在正常情况下下有可能低到了百万分之一。”

为了开发出一个能够更有效地将蛋白质传送到细胞中去的系统，David Liu和同事们采用了相反的方法，模拟了科学家们将DNA和RNA一类的核酸传送至细胞中去的方式。

这一系统依赖于称作为阳离子脂质的正电荷分子，其能够结合负电荷核酸形成脂质体。脂质体一旦形成，其可通过至少两种方式将内容物传递到细胞中。在某些情况下，脂质体有可能与细胞膜融合释放它的货物。此外，脂质体还可能与核内体膜融合释放出内容物。

“我们有一个非常简单的想法，即将研究人员用来传送DNA和RNA的商业化阳离子脂质用于传送蛋白质。这次我们没有采用超正电荷蛋白，而是利用了超负电荷蛋白，其类似于核酸处于高度的负电荷状态。利用阳离子脂质来传送与高度负电荷分子结合的蛋白质，相比于采用正电荷蛋白质或肽来传送蛋白质其效力提高了近1000倍。”

重要的是，研究小组的实验证实利用这一新系统来传送基因组编辑蛋白质，至少与传送编码基因组编辑蛋白的DNA所观察到的最好结果一样高效。而David Liu和同事们证实，传送蛋白质比传送DNA的基因组编辑特异性要高得多。

这样的结果正是研究人员所期望看到的。“传送DNA之后，在长时间内难以控制编码蛋白的表达量。DNA传送与期望的基因组编辑结果之间总是无法一致。在基因组编辑中，其任务是修复一个或两个拷贝的基因。而在基因组编辑蛋白完成这一任务后，你会想让它消失，因为在此之后它所做的就是不希望发生并有可能是有害的事情。”

“因此，短暂的、一时的蛋白质传递似乎比DNA传递更适合于大多数的基因组编辑应用。”

David Liu相信，最终基因组编辑蛋白有可能作为新一代的疗法来治疗一直以来难于治愈的一系列疾病。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo

Efficient intracellular delivery of proteins is needed to fully realize the potential of protein therapeutics. Current methods of protein delivery commonly suffer from low tolerance for serum, poor endosomal escape and limited in vivo efficacy. Here we report that common cationic lipid nucleic acid transfection reagents can potently deliver proteins that are fused to negatively supercharged proteins, that contain natural anionic domains or that natively bind to anionic nucleic acids. This approach mediates the potent delivery of nM concentrations of Cre recombinase, TALE- and Cas9-based transcription activators, and Cas9:sgRNA nuclease complexes into cultured human cells in media containing 10% serum. Delivery of unmodified Cas9:sgRNA complexes resulted in up to 80% genome modification with substantially higher specificity compared to DNA transfection. This approach also mediated efficient delivery of Cre recombinase and Cas9:sgRNA complexes into the mouse inner ear in vivo, achieving 90% Cre-mediated recombination and 20% Cas9-mediated genome modification in hair cells.