RPA技术试水二代测序的文库制备

生物通报道：重组酶聚合酶扩增RPA被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA扩增的速度非常快，灵敏度高，对硬件设备要求低，而且不需要复杂的样本处理。这样的技术特别适合于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域。

大规模并行测序技术（即二代测序NGS）是基因组和遗传学领域的一次技术革命。NGS自诞生以来，不论是测序规模还是测序效率都有了飞速的提升。尽管这一技术已经取得了巨大的成功，但有着极端碱基组成的基因组区域，对于目前的NGS平台来说仍然是一个很大的挑战。

不少重要的病原体都具有极端的碱基组成，比如疟原虫（高AT含量）和结核杆菌（高GC含量）。PCR扩增是标准的文库制备程序，不过PCR会导致不均匀的读取覆盖度（特别是在富含AT和GC的区域），最终影响基因组的装配和变异分析。而省却PCR扩增的文库制备方案，需要大量的初始材料，不适合处理从临床上分离的样本。

为此，Wellcome Trust Sanger 研究所的研究团队对测序文库的制备进行了优化，找到了既适合低量样本又耐受高AT含量的文库制备方案。这项研究发表在2012年的BMC Genomics杂志上。

研究人员用非临床和临床分离物（含大约53%的宿主污染物）制备Illumina测序文库，分别使用了不同的聚合酶、PCR和RPA方法，并对测序结果进行了分析和比较。他们在此基础上增强了高AT含量区域的测序覆盖度，减少了极端碱基组成带来的偏向性。

这项研究的RPA等温扩增直接使用了TwistAmp基础反应，没有进行任何优化。结果显示，RPA制备测序文库时产量相对较高，与标准Illumina文库制备相比，对极端碱基组成的模板偏向性较少，覆盖度有一定的提升。不过测序后的嵌合和重复读取（chimeric and duplicate reads）相对较多。（延伸阅读：核酸检测的一场革命，可替代PCR的犀利技术）

这次尝试说明，未来经过优化的RPA技术将有望用于二代测序的样本制备。（参考文献：Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.）