替代PCR，RPA在HIV检测中大显身手

【字体：大中小】 时间：2014年10月31日 来源：生物通

编辑推荐：

　　组酶聚合酶扩增RPA被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。目前婴儿HIV诊断的金标方法是DNA PCR，但许多地区并不具备这样的条件。在这种条件下，RPA技术正好可以大展身手。

生物通报道：重组酶聚合酶扩增RPA被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA扩增的速度非常快，灵敏度高，对硬件设备要求低，而且不需要复杂的样本处理。这样的技术特别适合于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域。

在HIV诊治中，即时检测是非常重要的，对婴儿来说更是如此。有案例显示，HIV感染后立刻进行治疗就能控制住患者体内的病毒，让它们无法进行复制。举例来说，生来就携带HIV的密西西比婴儿，在出生后立即得到了治疗。后来这个孩子停药了两年多，病毒复制依然得到了控制。

目前婴儿HIV诊断的金标方法是DNA PCR，但许多地区并不具备这样的条件。在这种条件下，RPA技术正好可以大展身手。（延伸阅读：核酸检测的一场革命，可替代PCR的犀利技术）

纸做的HIV DNA检测装置

2012年九月，研究人员开发了一个由纸、玻璃纤维和塑料制成的装置，用来对HIV的DNA进行RPA扩增。这个装置成本低、小巧轻便、而且易于使用，只需五步就能搞定HIV检测。扩增结果可以通过侧流层析试纸来读取。

人们可以先从婴儿的干血斑样本中提取DNA，然后再进行RPA扩增。研究显示，用这个装置进行RPA扩增反应，能在十五分钟内将10拷贝的HIV DNA扩增到可检出的水平。可见，这是一个前景广阔的低成本即时检测装置。（文献：A paper & plastic device to perform recombinase polymerase amplification of HIV DNA, Lab on a Chip）

RPA检测HIV DNA的实战效果

如果不能及时检测婴儿体内的HIV-1，就会延误治疗并影响治疗效果。2013年的一项研究设计了靶标HIV-1基因组不同区域（长末端重复LTR和pol）的两种探针。研究人员用这两个探针分别进行RPA扩增，然后进行荧光检测和侧流层析试纸检测。研究表明，这样的方法能够可靠地检测到3拷贝的前病毒DNA。研究人员在此基础上测试了多个HIV-1突变株，pol和LTR引物的扩增率分别为98.6%和93%。

这是一个能检测出HIV-1所有主要亚型的等温扩增法，能够在资源匮乏的地区帮助人们诊断携带被HIV感染的婴儿。（文献：Rapid detection of HIV-1 proviral DNA for early infant diagnosis using recombinase polymerase amplification, MBio.）

HIV DNA的实时定量检测

今年五月，研究人员使用内参和标准曲线，通过RPA扩增定量了HIV-1 DNA的浓度。这是一种基于实时荧光数据的定量RPA技术，被称为qRPA。

这项研究通过一系列试验，分析和定量了不同浓度的HIV-1 DNA样本。研究显示，在所有测试的浓度范围内，qRPA的预测值与正确值在一个数量级以内。可见，定量RPA（TwistAmp exo）可以作为核酸定量的有力工具，用于即时检测和体外诊断。（文献：Quantification of HIV-1 DNA using Real-Time Recombinase Polymerase Amplification, Analytical Chemistry）

不插电的HIV DNA检测

绝大多数核酸扩增（包括等温扩增）都需要电。但在资源匮乏的区域，最好是有不需要持续供电的诊断工具。RPA的工作温度在25-43°C之间，不需要严格控制孵育温度，就能达到理想的性能。

今年九月的一项研究显示，当室温在31°C - 43°C之间时，孵育20分钟RPA反应就能成功进行，检测到10拷贝的HIV-1前病毒DNA。

当室温降到30°C以下时，RPA的扩增性能有所下降。为此，研究人员开发了一个简单的化学加热器，在室温10-30°C时孵育HIV-1 RPA反应。研究显示，RPA的性能通过加热孵育得到了恢复，能检测到10拷贝的HIV-1前病毒DNA。

研究人员在15°C、20°C、25°C和30°C，用这种加热器进行了12个RPA反应，结果全部扩增成功。他们还发现，当温度较低时，孵育30分钟能促进RPA的扩增性能。研究表明，对RPA HIV-1反应进行化学加热，与电力设备效果差不多。这也说明，RPA HIV-1检测不需要多好的设备，就可以实现高灵敏度的诊断。（参考文献：Non-Instrumented Incubation of a RPA Assay for the Rapid & Sensitive Detection of Proviral HIV-1 DNA. PLoS One）