《相约2015NSFC》之lncRNA研究经典案例

随着2015年的自然科学基金申请日期的日益临近，广大科研工作者将开始新一轮的基金申请准备工作。锐博生物根据当前医学生物领域的热门研究方向，将陆续推出一系列的研究方案，内容涵盖《疾病相关lncRNA研究策略》、《疾病相关miRNA研究策略》、《siRNA文库高通量筛选策略》、《疾病相关Exosome研究策略》、《中医药分子水平作用机制研究策略》等，为科研工作者的课题申请提供参考，敬请关注！

案例一：lncRNA lnc-DC控制人类树突状细胞分化

lncRNA作用类型：作为配体保护转录因子STAT3磷酸化位点

研究者利用外周血单核细胞诱导分化为树突状细胞这一模型，通过转录组芯片及RNA-Seq，首先鉴别出一个在人DC中特异表达的lncRNA，并将其命名为lnc-DC。后利用ChIP-Seq确认lnc-DC基因转录起始位点处H3K4me3组蛋白修饰水平上升，转录调控因子PU.1亲和力增加，确定DC分化过程中lnc-DC上调原因。
其后，研究者使用慢病毒载体沉默DC中的lnc-DC，使用转录组芯片及流式细胞术分析，发现DC功能基因下调，多种T细胞激活关键蛋白下调，单核细胞标记上调。说明lnc-DC的缺失会改变DC分化趋势，影响DC功能。

通过RNA FISH确认lnc-DC定位于核内，RIP-Seq发现lnc-DC不会与AGO2和ALU元件结合。研究者使用生物素化lnc-DC，通过RNA pull down及MS分析，确认lnc-DC与转录因子STAT3互作。使用lnc-DC突变体及携带不同标记的STAT3分别进行RIP实验，确认lnc-DC与STAT3结合模式。最后通过免疫印迹、核内外免疫荧光检测及磷酸化分析，发现lnc-DC会阻止磷酸酶SHP1与STAT3的结合，保护Y705磷酸化状态，增强DC中的STAT3信号通路，以此实现其维持与促进人DC发育成熟和激活T细胞免疫应答的能力，最终对DC分化发育、抗原递呈与免疫激活功能起到至关重要的作用。

lnc-DC基因ChIP-Seq （上面三行）多位点ChIP-qPCR（中间两行）结果

lnc-DC/STAT3免疫印迹和RIP结果

 
lncRNA芯片数据

 
lnc-DC在人DC分化过程中作用模式图

相关文献：Wang P, Xue Y, Han Y, et al. The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation[J]. Science, 2014, 344(6181): 310-313.

案例二：lncRNA- PACER激活致癌基因COX-2表达

作用类型：转录调控/表观遗传调控

研究者怀疑致癌基因COX-2的转录控制与ncRNA有关，使用人乳腺表皮细胞（HMEC）进行ChIP实验，在COX-2转录起始位点（TSS）上游-0.3kb处，发现一个额外启动子，且这个启动子和COX-2启动子内有两个CTCF/cohesin二聚体的结合位点。沉默CTCF/cohesin，ChIP分析COX-2启动子及上游区域内染色质修饰水平，发现这两个二聚体所隔离出的染色质区域转录产生了一段lncRNA，研究者将此lncRNA命名为p50-Associated COX-2 Extragenic RNA，PACER）。对沉默PACER后的HMEC进行ChIP-qPCR实验，证实PACER可富集组蛋白乙酰基转移酶p300，促进染色质乙酰基化，影响RNA pol II复合物形成（RNAP II）。不过，RIP-qPCR发现PACER并非直接与p300互作，RIP及RNA蛋白互作实验证明NF-κB家族蛋白p50会与PACER结合，PACER则会促进结合在基因启动子上的基因抑制复合物p50/p50二聚体转化成p50/p65二聚体，实现富集p300的作用。

 

ChIP-Seq发现Cox-2 TSS上游有额外启动子

ChIP确认两个启动子区域内有CTCF/cohesin结合位点

ChIP验证CTCF沉默对不同组蛋白修饰的影响

RIP验证p50同PACER互作

PACER作用通路示意图

相关文献：Krawczyk M, Emerson B M. p50-associated COX-2 extragenic RNA (PACER) activates COX-2 gene expression by occluding repressive NF-κB complexes[J]. eLife, 2014, 3.

案例三：lncRNA通过超保守区域影响Drosha剪切产生成熟miR-195

作用类型：转录后调控/miRNA调控

miR-195已经证明与癌症细胞增殖与耐药性有关，在本项研究中，研究者希望进一步了解miR-195的调控机制，他们利用miRNA芯片检测HCT116细胞，通过分析差异miRNA种子序列，发现Uc.283+A这个lncRNA中的超保守区域（T-UCR）与pri-miR-195上Drosha剪切位点上游存在一段互补序列。EMSA实验证明pri-miR-195确实会同Uc.283+A互作。使用qPCR检测HCT116细胞和SK-N-BE(2)细胞中Uc.283+A与成熟miR-195表达状态，发现二者负相关；对其他数个类型癌细胞进行脱甲基化处理后发现，Uc.283+A、pri-miR-195和成熟miR-195中CpG岛被脱甲基化后，Uc.283+A、pri-miR-195会上调，但miR-195却会下调。使用野生型Uc.283+A与pri-miR-195进行体外孵育实验，Uc.283+A与成熟miRNA依然呈负相关，但如果使用pri-miR-195突变体或两个RNA互补区结合阻碍物进行孵育，成熟miR-195则不再受影响。

以上实验充分证明，Uc.283+A是利用T-UCR中与pri-miR-195的互补序列，下调成熟miR-195。因为两ncRNA互补区位于Drosha剪切位点上游，研究者假设这个过程是通过两RNA互补区结合影响Drosha对pri-miR-195的剪切。为此，研究者使用RNA antisense purification（RAP）法，发现两RNA之间的互补配对，会影响一个名为DGCR8的蛋白同pri-miR-195的结合，由于Drosha需要同DGCR8蛋白形成复合体才能对pri-miR-195进行剪切，Uc.283+A对DGCR8的影响会直接阻碍Drosha-DGCR8复合体形成，最终影响成熟miR-195的丰度。

Uc.283+A控制Drosha对pri-miR-195剪切机制示意图

 
RNA antisense purification（RAP）示意图

相关文献：Liz J, Portela A, Soler M, et al. Regulation of pri-miRNA Processing by a Long Noncoding RNA Transcribed from an Ultraconserved Region[J]. Molecular Cell, 2014.

案例四：HOTAIR改变染色质状态促进癌症转移

作用类型：表观遗传调控

通过超高密度tiling array及qPCR分析不同乳腺癌细胞（原发性乳腺癌细胞和转移型乳腺癌细胞），发现HOTAIR显著上调。沉默HOTAIR，通过活体成像可以明显发现癌细胞转移减弱。HOTAIR通常会与组蛋白H3K27甲基化酶复合体PRC2结合，发挥调控作用，通过ChIP-on-chip，发现在HOTAIR上调时，有854个基因被PRC2所结合，出现H3K27me3组蛋白修饰，许多基因都是癌症转移的正向调节因子，也说明HOTAIR会通过与PRC2互作，改变染色质状态促进癌症转移。

 
ChIP-on-chip结果

 
HOTAIR-PRC2互作，改变组蛋白修饰状态，影响癌症基因表达

相关文献：Gupta R A, Shah N, Wang K C, et al. Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis[J]. Nature, 2010, 464(7291): 1071-1076.

案例五：lncRNA拷贝数变异引发癌症

作用类型：转录调控/突变

本项研究中，研究者将目光集中于lncRNA拷贝数变异同癌症发生的关系上，他们分析了不同数据库中癌症样本的SNP检测结果，，筛选出188个出现SCNA的lncRNA，使用shRNA在数个癌细胞系中沉默这些lncRNA，发现在沉默FAL1基因（focally amplified lncRNA on chromosome 1）时在体内和体外都会显著减少癌细胞数目，将此lncRNA的cDNA导入卵巢表皮细胞，也会诱导细胞增殖，且在对128个卵巢癌晚期病人癌细胞进行检测后，发现FAL1的获得性SCNA与病人存活率降低有关。

为了探明FAL1获得性SCNA的致癌机制，研究者首先检测了更多癌细胞中FAL1 RNA转录情况，结果发现，FAL1 RNA转录同获得性SCNA为正向相关。使用RNA pull down、Western Bloting及RIP qPCR确认FAL1 RNA的结合蛋白为BMI1。由于BMI1又是PRC1（polycomb repressive complex 1）复合体的一个亚基，FAL1对BMI1的稳定又会进一步提高PRC1的稳定性。PRC1是一个染色体修饰复合物，会抑制很多基因表达。在癌细胞中用shRNA沉默FAL1或BMI1，发现表达量上升最大的是CDKN1A基因，该基因与癌症发生有关，而FAL1可能是通过调控BMI1在CDKN1A启动子的结合效率来控制CDKN1A的转录，提高CDKN1A表达量。另外，沉默FAL1会明显诱导癌细胞进入G0/G1期，增加细胞衰老速度，也进一步显示了FAL1的致癌作用。

 
RNA pull down流程及结果

 
 
RIP检测过程与结果

相关文献：Hu X, Feng Y, Zhang D, et al. A Functional Genomic Approach Identifies FAL1 as an Oncogenic Long Noncoding RNA that Associates with BMI1 and Represses p21 Expression in Cancer[J]. Cancer cell, 2014, 26(3): 344-357.

延伸阅读：

《相约2015NSFC》之疾病相关lncRNA研究策略

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