BioTechniques特辑：熔解曲线分析的前生

你曾经想知道谁首先想到凝胶电泳或ChIP，或如何提取DNA？他们的梦想是如何成为现实的呢？近期，BioTechniques发布特别系列文章，了解现代生物学中最有影响力的方法背后的故事和人。今天，让我们来了解一下熔解曲线分析，与PCR和实时荧光定量PCR（real-time PCR）反应仪初期密切相关的一种方法。

　　

生物通报道：你曾经想知道谁首先想到凝胶电泳或ChIP，或如何提取DNA？他们的梦想是如何成为现实的呢？最近，BioTechniques发布特别系列文章，了解现代生物学中最有影响力的方法背后的故事和人。今天，让我们来了解一下熔解曲线分析，与PCR和实时荧光定量PCR（real-time PCR）反应仪初期密切相关的一种方法。阅读更多……

像许多科学发现一样，熔解曲线分析（MCA）——高分辨率熔解曲线分析（HRMA）的前身——的发展，是通过一系列的偶然事件而发生的。在20世纪80年代后期，Carl Wittwer是美国犹他大学的临床病理学助理教授，他的一部分工作是，监测新方法在学校ARUP临床实验室的潜在应用。其中一种更有趣的方法就是初出茅庐的RCR技术。

在从一个同事那里了解到如何利用水浴进行PCR之后，Wittwer决定创建他自己的PCR热循环仪，因为当时还没有市售的PCR仪。Wittwer回忆说：“当我还是一个孩子的时候，有时候会拆卸电视机，然后再把它们重新组装回去。改变温度听起来并不是太难。”

在设计他的热循环仪的过程中，Wittwer决定使用循环热风和冷却风扇，来加热和冷却包含在玻璃毛细管中的PCR样本。这种设计的一个意想不到的优势是，能够非常迅速地改变PCR样品的温度。

Wittwer说：“在PhD训练期间，我曾是一名分析生物化学家，所以还有什么比玩速度和确定PCR的温度及时间要求更有趣呢？”经过仔细地优化PCR循环每个阶段的时间和温度，并使PCR循环时间显著少于更传统的使用加热器的热循环仪，Wittwer最终发明了一种快速的热循环仪，虽然这并不是他最初的计划。这一发明，于1991年发表在BioTechniques，带来了下一个LightCycler实时PCR机器的产生。

当时，在他的临床病理学工作中，Wittwer已经在使用流式细胞仪。Wittwer指出：“现在，只要你想到流式细胞仪，用荧光检测细胞。用荧光检测一个或多个毛细管，没有什么不同；并非太大的跳跃。利用快速PCR，我们可以用光学透明的玻璃毛细管，只是需要用荧光来检测。”

Wittwer将一台流式细胞仪没有被使用的荧光计拆下来，将其加到他的快速PCR循环仪中，这就是20世纪90年代早期LightCycler的原型。通过添加一种染料，一旦双链DNA（dsDNA）与PCR反应结合，染料会发出荧光，研究人员就可能在实时快速的PCR反应过程中，对扩增子的形成不断地进行荧光监测。

在这个追求过程中Wittwer并不孤单。在1992年，Russell Higuchi发表了一篇论文，利用溴化乙锭（EB）作为一种dsDNA结合荧光染料，用于PCR的实时监测。然而，Wittwer决定寻找另一种dsDNA结合染料，由于EB的毒性，研究人员对使用它持保留态度，其他dsDNA结合荧光染料被认为不耐热。当时，Wittwer实验室正在检测，将SYBR Green I作为DNA凝胶着色中的一种EB替代物。他们有些天真地认为，如果他们能够看到SYBR Green I荧光（由于其与凝胶中dsDNA的结合），为什么不在溶液中使用它来监测PCR反应？所以他们尝试着在配备荧光计的快速循环仪中，向PCR反应中添加不同浓度的SYBR Green I，获得了一种很好的实时荧光信号。

Wittwer新的实时荧光定量PCR仪器测量三个参数：时间和温度，所有热循环仪都可测量，加上荧光性，这个新参数用实时荧光定量PCR测量。Wittwer想知道：“这三者当中，我们可以放在一起的两个组合是什么？当然，我们看到的有趣组合是，以熔解分析而告终的组合。如果你在Y坐标轴绘制荧光性，在X坐标轴绘制温度，你就会得到一个熔解曲线图。”

当他在实时荧光定量PCR反应循环过程中连续监测这个图时，Wittwer 指出：“当在85到90度范围内时，荧光率的变化很快，并且开始时我们不知道那是什么。但是如果你再多考虑一下，很明显，它很可能是双链DNA解链。”

根据这一观察结果，Wittwer意识到，由加热扩增后的PCR产物所获得的荧光熔解曲线与温度，可以区分扩增产物，因为每一个扩增产物的熔解曲线都是基于其长度、序列和GC含量。这是MCA的基础，他将相关研究结果发表在1997年的《Analytical Biochemistry》杂志。MCA允许我们粗略地描述扩增子，对于区分目标扩增子和非特异性产物（如引物二聚体）的存在很有用，而无需在PCR反应后跑凝胶电泳。

随着后来的改进，包括大大提高仪表化和使用探针（如标记的序列特异性寡核苷酸或更好的dsDNA结合染料），MCA就发展成为HRMA，它足够敏感，可用于分型特异的序列变异，并可在定义的感兴趣区域内检测以前未知的序列改变。虽然现在有许多不同版本的HRMA，已被广泛用于基因分型和扫描，但它们的存在，都归功于Wittwer最初建立自己热循环仪的决定所触发的一系列偶发事件。

（生物通：王英）

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Patrick C.H. Lo. The Moments: Melting Curve Analysis. BioTechniques. http://www.biotechniques.com/news/The-Moments-Melting-Curve-Analysis/biotechniques-354585.html