华人学者解析DNA解旋机制的起源

驱动DNA复制的蛋白质——细胞生长和繁殖背后的动力，是地球上一些最复杂的机器。这一多步复制过程包括数以百计的光原子级运动部件，可快速地相互作用和变换。定位这些密集的分子机器，是医学和生物学领域最有前途和富有挑战性的前沿。目前，科学家们已经查明了复制过程开始的关键步骤，相关研究发表在2014年10月15日的《Genes and Development》杂志。

　　

生物通报道：驱动DNA复制的蛋白质——细胞生长和繁殖背后的动力，是地球上一些最复杂的机器。这一多步复制过程包括数以百计的光原子级运动部件，可快速地相互作用和变换。定位这些密集的分子机器，是医学和生物学领域最有前途和富有挑战性的前沿。

目前，科学家们已经查明了复制过程开始的关键步骤，其中“解压缩”和分裂DNA双螺旋、以使两部分可作为DNA复制模板的酶，研究人员解开了其令人惊讶的结构细节。

本研究将电子显微镜、精心提炼的蛋白质和一种化学冷冻法相结合，分离DNA复制开始的特定时刻。这项研究发表在2014年10月15日的《Genes and Development》杂志，作者分别来自于美国能源部布鲁克黑文国家实验室、石溪大学、冷泉港实验室和伦敦帝国学院。

本研究共同作者、布鲁克黑文实验室终身研究员和石溪大学生物学家李慧林（Huilin Li）称：“DNA解旋机制的起源是非常复杂和令人惊讶的。能在分子水平上看到这个解旋酶准备包围并解开DNA，可帮助我们了解生命的最基本过程，以及这个过程可能会出现什么错误。复制DNA出错存在于某些癌症中，这项工作将有助于开发新的治疗方法，停止或打破危险失控的机器。”

本研究选取了Li及其同事以前中断的两项研究。他们首先确定了“起始识别复合物”（Origin Recognition Complex，ORC）——一种蛋白质，可识别和结合特定DNA位点，启动整个复制过程。第二项研究揭示了ORC如何招募、裂开和安装一个至关重要的环形蛋白质结构（Mcm2-7），其位于解旋酶的核心。

但是，DNA复制是一个双向的过程，两个解旋酶朝着相反的方向进行。那么，关键问题是，第二个解旋酶核心如何以第一个解旋酶相反的方向，招募并加载到DNA上？

本文第一作者、布鲁克黑文实验室生物学家Jingchuan Sun说：“让我们感到惊讶的是，我们发现了一个中间结构，具有结合两个环的ORC。这一发现表明，一个单一的ORC，而不是通常认为的双ORC系统，负载有两个解旋酶环。”

接下来，研究人员也确定了ORC离开系统后所留最终双环结构的分子结构，从而提供了一些关键的生物学见解。

本文共同作者、伦敦帝国学院的Christian Speck称：“现在，我们有双环结构如何稳定逗留、直到细胞进入DNA合成期的线索。这项研究揭示了关键的调控规则，可解释解旋酶活性最初是如何被抑制，然后如何被再活化以开始其裂开DNA工作。”

精确的方法，密切的合作
检测这些转瞬即逝的分子结构，需要掌握生物学、化学和电子显微镜技术。

本文共同作者、冷泉港实验室的Bruce Stillman称：“这种三路合作，利用每个实验室的长期合作和专业知识。帝国学院和冷泉港负责具有挑战性的材料制备和功能特性，而布鲁克黑文国家实验室和石溪大学带领了复杂的分子成像和三维图像重建。”

研究人员使用来自面包酵母（一种模式生物，用于动物更复杂的系统）的蛋白质。科学家分离了参与复制的蛋白质机制，并消除了可能使图像复杂化的结构。

一旦分离的蛋白质与DNA混合，科学家们每隔2、7和30分钟就注入化学物质，以“冻结”结合和补充过程。

然后，他们使用布鲁克黑文国家实验室的一种电子显微镜，在一种分子延时的每个目标时刻，确定了其确切结构。这种技术不是使用传统的显微镜的光，而是使用电子聚焦光束来照亮样品，具有原子级分辨率。该仪器可产生大量的二维电子束图像，然后用计算机重建成三维结构。

Li说：“这种技术非常理想，因为我们成像相对大的蛋白质。一个典型的蛋白质含有三百种氨基酸，但是这些DNA复制机器包括成千上万的氨基酸。整个结构大约20纳米，而普通蛋白质大约4纳米。”

在最基本的层面上解开这个DNA过程，是该研究团队的工作重点，也具有深远的意义。Li说：“这些结构知识可以帮助其他研究人员设计小分子，在特定时刻抑制DNA复制，从而带来新的疾病预防和治疗方法。”

（生物通：王英）

延伸阅读：

生物通推荐原文摘要：
Structural and mechanistic insights into Mcm2–7 double-hexamer assembly and function
Abstract: Eukaryotic cells license each DNA replication origin during G1 phase by assembling a prereplication complex that contains a Mcm2–7 (minichromosome maintenance proteins 2–7) double hexamer. During S phase, each Mcm2–7 hexamer forms the core of a replicative DNA helicase. However, the mechanisms of origin licensing and helicase activation are poorly understood. The helicase loaders ORC–Cdc6 function to recruit a single Cdt1–Mcm2–7 heptamer to replication origins prior to Cdt1 release and ORC–Cdc6–Mcm2–7 complex formation, but how the second Mcm2–7 hexamer is recruited to promote double-hexamer formation is not well understood. Here, structural evidence for intermediates consisting of an ORC–Cdc6–Mcm2–7 complex and an ORC–Cdc6–Mcm2–7–Mcm2–7 complex are reported, which together provide new insights into DNA licensing. Detailed structural analysis of the loaded Mcm2–7 double-hexamer complex demonstrates that the two hexamers are interlocked and misaligned along the DNA axis and lack ATP hydrolysis activity that is essential for DNA helicase activity. Moreover, we show that the head-to-head juxtaposition of the Mcm2–7 double hexamer generates a new protein interaction surface that creates a multisubunit-binding site for an S-phase protein kinase that is known to activate DNA replication. The data suggest how the double hexamer is assembled and how helicase activity is regulated during DNA licensing, with implications for cell cycle control of DNA replication and genome stability.