Nature Methods：评估荧光蛋白的光激活效率

　　

生物通报道：光控的荧光探针，是对局部进行超高分辨率显微分析的核心。其中，荧光蛋白可以通过基因编码，实现与目的蛋白的1:1标记。所以，荧光蛋白探针特别适合于单分子计数。

近日，ICFO的科学家们首次在单分子水平上，确定了多个荧光蛋白的光激活效率，这一参数对于单分子计数非常重要。文章发表在一月五日的Nature Methods杂志上。

有时，蛋白必须以“寡聚体”形式行使功能，而某些蛋白的“寡聚化”会引发疾病。因此，在纳米尺度上分析蛋白的组织形式，是理解蛋白功能的基础，有助于展现正常细胞和患病细胞之间的差异。许多研究者致力于对蛋白进行分子定量，监控单体、二聚体和多聚体蛋白之间的平衡。

Dr. Melike Lakadamyali领导研究团队，对所有已知的“不可逆光控荧光蛋白”，进行了光激活效率的检测，为蛋白的分子定量，提供了相当详细的参考框架。他们用爪蟾卵母细胞表达的人类甘氨酸受体作为纳米模板，对多种荧光蛋白进行分析，确定了被光激活的蛋白比率。

“分子计数”的实现，依赖于光激活的荧光蛋白，以及超高分辨率的显微镜。这些荧光蛋白受到（激光）照射时，会由暗变亮。人们可以通过超高分辨率显微镜，激活、成像和跟踪基因编码的荧光蛋白，以展现细胞内的蛋白活动。

这样的成像方案，理论上可以对目标蛋白进行分子定量。但实际上，将荧光蛋白的数量与真实蛋白联系起来并不容易。这一问题的首要原因是，人们并不确定，在激光照射时是否所有的荧光蛋白都发光。如果一部分探针光激活失败，就无法出现在图像上，导致计数时遗漏部分数据。

研究人员在光激活效率和一些其他因素（如荧光闪烁）的基础上，确定了最适合进行分子计数的荧光蛋白。研究显示，没有哪种荧光蛋白是完美的，绝大多数荧光蛋白有50%的失败率。研究人员强调，将光激活效率纳入考虑，对于正确解读定量信息非常重要。

Dr. Lakadamyali指出，“目前人们只能用不完美的荧光蛋白进行研究，同时在定量蛋白时注意这种限制。不过，我们开发了鉴定光激活效率的可靠方法。日后在设计荧光蛋白时，可以通过这种方法优化参数，生成更适合超高分辨率分子计数的探针。”

 

（生物通编辑：叶予）

生物通推荐原文摘要：

Single-molecule evaluation of fluorescent protein photoactivation efficiency using an in vivo nanotemplate

Photoswitchable fluorescent probes are central to localization-based super-resolution microscopy. Among these probes, fluorescent proteins are appealing because they are genetically encoded. Moreover, the ability to achieve a 1:1 labeling ratio between the fluorescent protein and the protein of interest makes these probes attractive for quantitative single-molecule counting. The percentage of fluorescent protein that is photoactivated into a fluorescently detectable form (i.e., the photoactivation efficiency) plays a crucial part in properly interpreting the quantitative information. It is important to characterize the photoactivation efficiency at the single-molecule level under the conditions used in super-resolution imaging. Here, we used the human glycine receptor expressed in Xenopus oocytes and stepwise photobleaching or single-molecule counting photoactivated localization microcopy (PALM) to determine the photoactivation efficiency of fluorescent proteins mEos2, mEos3.1, mEos3.2, Dendra2, mClavGR2, mMaple, PA-GFP and PA-mCherry. This analysis provides important information that must be considered when using these fluorescent proteins in quantitative super-resolution microscopy.