哈佛华裔牛人Nature子刊解析Cas9特异性

　　

生物通报道  Cas9是一种可通过一条RNA链进行重编程，靶向特异DNA序列进行精确切割、粘贴，开启或关闭基因的蛋白质“机器”。自从Cas9被发现以来，研究人员一直利用它来作为一把有潜力的钥匙开启遗传疾病新疗法。但这一切只有在完全了解它的运作机制的条件下才能实现

这就是David R. Liu和他的学生Vikram Pattanayak以及John Guilinger在从事的工作。

David R. Liu现为哈佛大学化学及化学生物学教授，霍华德休斯医学研究所研究员。据称这位教授是一位从来没有做过博士后的年轻教授，他早年毕业于哈佛大学，1999年在加州大学伯克利校区攻读博士学位，在Peter Schultz教授指导下从事核糖核酸研究，并自主首次开始活细胞遗传密码的研究。之后就被哈佛大学任命为助教授，2004年晋升为教授。Liu教授曾被麻省理工学院技术评论列入全球Top 100 青年发明家（35岁以下），“大众科学”亦将其列入全美Top10最具才气的青年科学家。

David R. Liu联合加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna教授，率先对Cas9进行了一次详细的特异性分析，揭示了Cas9能够导向其编程靶向的DNA序列的精确度，以及这一蛋白质/RNA复合物对于诱饵脱靶序列的敏感度。这项工作描述在近期的《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上。

David R. Liu说：“一个重要的问题决定了像Cas9这样的技术多大程度上可以成为有用的研究工具，尤其是用于人类治疗：就是它们的特异性。”

“众所周知，有能力操控我们的基因组结构有可能会对人类的健康产生深远的影响。但在你施予患者某些将改变他们基因的治疗之前，你需要非常地确定它将不会在别处造成意料之外的效应，因为切割一个靶位点以及脱靶位点有可能意味着导致治疗疾病或是触发癌症形成两种不同的结局。”

尽管Cas9有望操控人类基因组，但这一系统是以细菌的免疫系统为基础生成。

不同于人类免疫系统生成抗体来对抗疾病，细菌是将一小部分病原体DNA插入到它们自身的基因组中。利用这一外源DNA片断来重编程Cas9机器，细菌可以击退病原体的感染。

在实验室中利用Cas9始于研究人员发现了一个独特的兴趣位点，其长度大约是20-23个碱基对。研究人员随后设计出了一条只匹配这一靶DNA片段的“引导”RNA单链。当Cas9机器和这条引导RNA在靶DNA位点上遭遇时，Cas9会执行它的功能。Cas9可自然切割DNA，研究人员已经设计出了一些Cas9变异体来开启或关闭靶基因的表达。

David R. Liu说，问题在于尽管理论上Cas9/RNA复合物仅结合到基因组的特异位点，但却从来没有对其精确度进行过充分的研究。

“我们可以设计出极好地匹配一个特异性DNA位点的RNA，但基因组非常的巨大。在基因组的别处有可能存在非常相似的序列。问题是，如果在基因组中有另一个位点与靶序列的差异仅为1个碱基，2个碱基，或是4个碱基时，Cas9会切割这些脱靶位点吗？”

研究人员还解答了一些其他的问题，包括是否容许靶DNA各个位点发生多处错配，这一20个碱基对序列的错配是否或多或少与它们横跨引导RNA的位置有关系？引导RNA的结构有可能如何影响这一系统的准确性？

他们发现尽管整个RNA序列对于将Cas9传送至正确的位点起重要的作用，对于错误的容忍度可随靶向的基因组位点，以及错配发生在引导RNA序列的位置而发生改变。

更重要的是，研究人员发现提高Cas9的浓度以及改变引导RNA的结构，都可以提高Cas9的活性，导致准确性降低。

David R. Liu说：“一个重要的信息就是要在活性和特异性之间进行权衡。这是一个重要的教训，因为当科学家们开发这些工具成为有希望的治疗时，他们需要确保在提高活性时，不会导入新的脱靶切割效应。”

为了避免这些问题，David R. Liu和其他的研究人员正致力于设计能够比自然进化的这一系统更为精确的Cas9版本。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity

The RNA-programmable Cas9 endonuclease cleaves double-stranded DNA at sites complementary to a 20-base-pair guide RNA. The Cas9 system has been used to modify genomes in multiple cells and organisms, demonstrating its potential as a facile genome-engineering tool. We used in vitro selection and high-throughput sequencing to determine the propensity of eight guide-RNA:Cas9 complexes to cleave each of 1012 potential off-target DNA sequences. The selection results predicted five off-target sites in the human genome that were confirmed to undergo genome cleavage in HEK293T cells upon expression of one of two guide-RNA:Cas9 complexes. In contrast to previous models, our results show that guide-RNA:Cas9 specificity extends past a 7- to 12-base-pair seed sequence. Our results also suggest a tradeoff between activity and specificity both in vitro and in cells as a shorter, less-active guide RNA is more specific than a longer, more-active guide RNA. High concentrations of guide-RNA:Cas9 complexes can cleave off-target sites containing mutations near or within the PAM that are not cleaved when enzyme concentrations are limiting.