让我们轻松揭开exosome的秘密[新品推荐]

exosome是一种直径约为30-150 nm的小囊泡。它们不仅由所有培养的细胞所分泌，还天然存在于各种体液中，参与细胞间通讯，或支持或干扰不同的生理过程。对于这一新兴的研究热点，生物通在这里为您推荐一系列全新的标准化研究工具，让您可以将更多精力专注于exosome通路和生物学功能的研究上。

大家都知道，细胞不断向细胞外空间分泌大量的小囊泡、大分子复合物及小分子。在这些小囊泡中，有一种正受到广泛的关注，这就是exosome。exosome的直径约为30-150 nm。它就像一辆小卡车，运载货物穿梭于身体的不同部位之间。

小卡车上到底装了什么？大家都想了解。很多年来，人们一直以为只有一些垃圾袋，让细胞丢弃不必要的蛋白。然而，如今看来却并非如此，exosome也携带了一些重要的信号分子，如miRNA、ncRNA、mRNA等，至少在某种程度上实现了细胞间的通讯。因此，小小的exosome似乎有着重要的功能，也有着大大的临床应用前景。

从被遗忘到被重视

exosome的发现要追溯到30年前。研究人员陆续发现大鼠网织红细胞、绵羊红细胞等分泌小囊泡。在分离了这些小囊泡之后，他们发现了多种有活性的酶。至此，exosome的蛋白运输功能被研究界所接受，然而，之后exosome似乎完全被人遗忘。直到2007年，研究人员发现了RNA运输功能，exosome才重新成为人们关注的对象。

exosome不仅由所有培养的细胞所分泌，还天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液和母乳。无论是细胞分泌到培养基中的exosome，还是各种器官分泌到体液中的exosome，都参与了细胞间通讯，或支持或干扰不同的生理过程。

早期的研究发现，exosome能够特异靶定受体细胞，交换蛋白和脂类或引发下游信号事件。这种小囊泡参与了多个过程：免疫反应的促进剂、抗原呈递、程序性细胞死亡、血管生成、炎症和凝血等。此外，它还参与了发育和分化。

不仅如此，这辆小卡车还运载了特异的核酸货物，参与了细胞间通讯。Valadi等发现，MC/9和人肥大细胞系分泌的exosome包含了来自约1300个基因的mRNA以及小RNA，包括121个microRNA。这项成果犹如一枚重磅炸弹，在研究界引起轰动。

于是乎，人们对exosome的兴趣激增，从它们在体内的功能到更为实际的应用 – 诊断和治疗方法的开发。据统计，目前已有1500多篇有关exosome的文章发表，其中大部分是在近3年内发表的，而国际细胞外囊泡协会（ISEV）于去年成立，更是立即吸引了700多名会员加入。

鉴于所有体液中都包含exosome，且其蛋白、RNA和脂肪成分特异，exosome有望在多种疾病的早期诊断中发挥作用。与传统的活检相比，微创（抽血）或无创（使用尿液或唾液）诊断方法减少了患者的痛苦和不便，也降低了分析成本。近两年，多个研究团队对血液、尿液和唾液中的exosome进行研究，发现了多种疾病的生物标志物，有望指导疾病的个性化治疗。

exosome的研究该如何下手

阅读至此，相信大家都已经跃跃欲试了吧。不过，exosome的研究该如何下手呢？首先自然是从细胞培养基或体液中分离出总exosome，亚群的分离检测；接着是回收里面的RNA或者蛋白质货物；再通过qRT-PCR等方法进行深入的功能分析。新的研究方向虽容易发表文章，也面临着更大的挑战，因为研究方法还不成熟，市售工具相当少，可能需要花费大量时间去开山辟路优化方法。生物通在这里为您推荐一系列全新的标准化研究工具，让您可以将更多精力专注于exosome通路和生物学功能的研究上。

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exosome的分离

早前发表的一些研究主要是从淋巴细胞、胚胎干细胞以及血清、唾液和母乳中提取出exosome并回收RNA，再利用qRT-PCR和新一代测序来进行鉴定和分析。它们在分离时往往是采用超速离心的方法。这的确是一种经典的方法，能制备出干净的exosome。但是，缺点也不少：耗时耗力，往往需要8-30个小时；每次最多只能处理6个样品；需要大量的起始材料；产量不高。最重要的是，你得有台超速离心机，还要有丰富的经验。

如果有个试剂盒，像提质粒那样轻松地提取出exosome，那就再好不过了。幸好，这样的试剂盒已经上市。Life Technologies公司旗下Invitrogen品牌推出了多款总exosome提取试剂盒，能分别从细胞培养基、血清、血浆、尿液及其他体液中分离完整的exosome。与超速离心相比，这种方法实在是简单省事多了。

这种试剂通过捆绑水分子，将溶解度不太高的组分（如囊泡）挤出溶液，从而可通过常规离心来收集。样品先经过2000xg 30分钟低速离心以去除细胞碎片，根据样品类型加入指定比例的提取试剂并混匀，并在2-8°C孵育一定时间（血清样品只需4度孵育30分钟，培养基上清则需孵育过夜），然后通过常规离心（10,000 x g，10-60分钟，因样品类型而异）即可回收exosome沉淀。其中手动操作部分仅需15-20分钟，甚至比提质粒还简单。之后用PBS或类似溶液重新溶解沉淀。这下，exosome可立即用于下游分析或进一步的纯化啦。

Life Tech的平行比较试验结果显示，试剂法与超速离心法提取出的exosome相当。在NanoSight® LM10仪器上分析的图谱显示，所有囊泡均小于300 nm，且大部分处于exosome的典型大小范围30-150 nm（图1）。

图1. 从HeLa细胞培养基中回收的Exosome的分析。(A) 采用总Exosome提取（从细胞培养基中）回收的Exosome的大小分布与 (B) 采用传统的蔗糖密度梯度超速离心实验方案提取的Exosome相当。

分离亚群

在获得了总的exosome之后，您还可以通过磁珠提取出高纯度的亚群。例如Dynabeads®磁珠可捕获表达CD63的exosome，用于下游的流式细胞仪、电镜或Western blotting分析。超顺磁的Dynabeads呈浅棕色，因此在整个操作过程中您都可以“查看”您的样品。此外，样品量和磁珠量也能轻松调整。当然，您也可以不选CD63，而通过生物素化的抗体和链霉亲和素试剂来富集您感兴趣的亚群。

完整exosome的分析

分离过程结束后，您可能想要观察和确认一下这些小囊泡。不过，exosome的观察还真不简单，因为它们太小了。目前，研究人员多借助以下工具和方法。

在收集到exosome之后，我们可利用NanoSight® 仪器来分析囊泡的大小范围和浓度。这款仪器根据Stokes-Einstein 原理，将每一个进行布朗运动的颗粒直径计算出来。它既提供直接实时的纳米颗粒观察，也给出全面的颗粒粒径分布分析。

若没有NanoSight，那也没关系。通过RNA或膜组分的标记，我们也能在显微镜下观察exosome。Life Tech还提供了专门的Exosome离心柱（MW 3000），能够快速去除未掺入的染料。同时，这些离心柱也能用于缓冲液交换，或去除低分子量的杂质，如盐、核苷酸和小的寡核苷酸。此外，经过Dynabeads®磁珠富集的亚群可直接用于电镜和流式细胞仪（图2）。

图2. 利用流式细胞仪观察CD63+ Exosome。Exosome结合至包被有CD63（A和B）的乳胶微球或包被有生物素化的CD63（C和D）的Dynabeads® 链霉亲和素上，并进行CD63-PE染色。FSC/SSC (1,500次)和荧光直方图如图所示。

exosome货物的分离与分析

核酸与蛋白的分析对于许多研究人员来说已经是驾轻就熟了。Life Tech的总Exosome RNA和蛋白分离试剂盒能够从同一样品中分离蛋白和总RNA。试剂盒的标准化操作为实验带来可重复的结果。此外，您也可以通过Exosome免疫沉淀试剂盒，借助Dynabeads®磁分离技术来温和地分离出完整的exosome蛋白复合物。

这之后，就等你大显身手了。无论是利用Western blot来分析exosome蛋白，或是利用qRT-PCR或RNA-seq来分析RNA，exosome这种信号传导的新途径无疑将为您揭开一个新的研究篇章。

exosome这些迷人的小卡车，每天兢兢业业地在细胞之间穿梭，传递着重要的讯息。尽管这还是个年轻的研究领域，但有了不断上市的新工具，相信我们对exosome的了解会更加深入，更多exosome的秘密将会揭开。

如果您有兴趣了解exosome研究方面的最新进展，欢迎加入Life Tech的在线培训资源。您也可以登陆exosome的技术论坛：Exosomestalk（http://exosomestalk.com/），交流exosome相关的信息，提交自己的疑问。Life Tech的“exosome之家”页面也列出了所有相关产品信息，供您查看。（生物通 余亮）

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参考文献

1. Vlassov AV, Magdaleno S, Setterquist R, Conrad R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 2012 Jul;1820(7):940-8.

2. Zeringer E, Li M, Barta T, et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 2013 March 26; 3(1): 11-18.