Biotechniques：数字PCR带来NGS文库的精确质控

　　

生物通报道 美国西雅图福瑞德•哈金森癌症研究中心（Fred Hutchinson Cancer Research Center）的研究人员发现，微滴式数字PCR（ddPCR™）可作为一种精确的方法，用于新一代测序（NGS）文库的质量控制。这项研究成果发表于《Biotechniques》8月刊上。

目前的各种NGS技术都需要用户将精确量的DNA文库分子上样到仪器上，以便优化数据产量。若测序运行时的文库分子过多或过少，都会使数据质量受损，有时甚至没有数据。这不仅浪费宝贵的样品和试剂，也浪费用户和仪器的时间。

此外，如果文库分子的长度不适合，未充分利用测序平台，那么测序所得的碱基较少，从而限制了通量。鉴于此，定量文库分子和确定片段的大小范围已成为文库制备中的关键步骤。

NGS仪器制造商通常建议使用实时定量PCR来定量文库，并利用凝胶或毛细管电泳来确定其大小范围。此外，也可以使用Qubit荧光计和Agilent Bioanalyzer。这些方法都存在一些限制，不是很理想。尽管qPCR被普遍认为是文库定量的最佳方法，但它也有一些缺点，包括扩增偏向和需要标准曲线。

为了在单个ddPCR分析中同时定量并确定目标DNA的大小分布，Jason Bielas博士及其同事利用了微滴荧光振幅与扩增子大小之间的关系。他们确认了这种方法应用于NGS文库制备的准确性和精确度。

他们开发出一种新的分析，可测定未知可扩增DNA模板的绝对浓度和长度，非常适合NGS文库的质量控制。这种分析名为QuantiSize，是利用Bio-Rad公司的QX100微滴式数字PCR系统开发的。QuantiSize能够定量单个反应孔中目标DNA的绝对量，并确定其大小分布，同时避免了其他独立的定量和大小测定方法的缺点。

Bielas认为：“既然我们已经发现了这一新关联，我们也可以利用ddPCR，根据每个微滴的荧光振幅，来提取有关DNA特性的更多信息。”

下一步，Bielas博士计划利用ddPCR荧光和扩增子大小之间的关系来探索人类核基因组和线粒体基因组中的突变事件。（生物通 薄荷）

了解QX100微滴式数字PCR系统的更多信息

原文检索

Simultaneous digital quantification and fluorescence-based size characterization of massively parallel sequencing libraries

BioTechniques, Vol. 55, No. 2, August 2013, pp. 61–67