单细胞分析之全攻略（下）[选购宝典]

近两年，单细胞分析发展迅速，文章数以每年40%的速度增长。单细胞方法让微生物学家能够着手研究无法培养且数量有限的微生物，同时也让干细胞研究人员能够深入了解细胞的编程和分化。这一切，都多亏了分析工具的快速发展，比如细胞分离、单细胞测序、单细胞蛋白质组学和转录组学以及高内涵成像。

单细胞转录组学和蛋白质组学

NanoString Technologies的科学家发现，细胞群体的RNA平均表达水平不一定与群体中单个细胞的RNA表达相同。例如，有些基因持续在低水平表达，而另一些则在短时间内大量表达。对宏观测定而言，这样的表达模式被平均化。

该公司独特的数字表达谱分析系统能直接对单个RNA分析进行计数，最多可分析单细胞中的800个不同分子。这是利用nCounter Single Cell Gene Expression Assay中的分子条形码来实现的，它识别特定的RNA分子。单细胞样品在裂解后，经过逆转录和预扩增，随后与分子条形码杂交，纯化后在nCounter®分析仪上读取。

哈佛大学的Hongkun Park研究小组与Broad研究院的Aviv Regev研究小组合作，来研究看似均质细胞中的基因表达异质性¹。Park、Regev及其同事利用一种称为Smart-Seq的技术，来读取RNA转录本的覆盖。与原先的RNA-Seq方法相比，Smart-Seq让研究人员能够更详细了解mRNA选择性剪接所产生的异构体，同时更好地鉴定单核苷酸多态性（SNP）。

通过计算机分析，Regev和Park发现，mRNA丰度和剪接模式都存在之前未观察到的双峰（bimodal）变化，并通过RNA-荧光原位杂交（FISH）对精选转录本进行了验证。如今，他们正在扩展样品类型。Park谈道：“目前我们正将单细胞RNA-Seq方法应用在各种免疫细胞、神经细胞和癌症细胞上，以便了解驱动细胞之间变化的因素、这种变化的动力学及其生物学影响。”

Regev和Park的团队也在探索另一种新技术，最初由斯坦福大学Garry Nolan实验室开发的CyTOF Mass Cytometry。这种方法结合了质谱和流式细胞术，让研究人员能够分析单细胞所表达的几十种不同的mRNA或蛋白质。CyTOF由DVS Sciences公司推出，曾被The Scientists杂志评为2011年十大创新技术之一。

RNA测序领域的另一项进展是RNA-capture-seq，在测序之前用Tiling芯片来放大转录组的一部分。这样能带来更好的分辨率，并且只关注感兴趣的区域。安捷伦科技公司提供这种目标捕获的工具，Illumina和罗氏NimbleGen也有。

安捷伦的高级产品经理Anniek De Witte认为，目标富集策略，如RNA-capture-seq，特别适合临床研究应用，其中细胞极其稀少，如循环肿瘤细胞，或胚胎活检的单细胞。研究人员也会对异质的肿瘤样本感兴趣，因为每次研究一个细胞非常重要。

高内涵成像

随着成像系统的分辨率以及试剂的不断改善，显微镜专家也开始将他们的注意力转移到单个细胞。赛默飞世尔科技为单细胞和细胞群体的高内涵成像和分析提供了工具。他们的仪器有Thermo Scientific™ ArrayScan™和CellInsight™高内涵成像仪；他们也为高内涵成像时的多重分析提供试剂和抗体。

高内涵，意味着从单个细胞中提取大量信息。因此，赛默飞世尔的仪器都配备了灵敏的检测器，尤其适合那些昏暗的样品，或者活细胞样品，为了减少光毒性作用而不得不采用弱光。其中一个例子就是ArrayScan Infinity高内涵平台，它的共聚焦模块特有增强分辨率的功能，如高速Nipkow转盘技术和可变针孔（pin-hole），可精确控制目标内的图像获取。

高内涵分析过去主要在制药研究中开展，而如今也渐渐普及到科研机构。通用电气医疗集团生命科学部细胞技术方面的首席科学家Nick Thomas也看到了科研和制药机构之间的需求转变。该公司的高内涵筛选仪器IN Cell Analyzer过去主要用在制药公司，但在最近几年，客户基础发生了一些改变。据介绍，相当一部分的仪器及组件是出售给了科研机构。

随着这种转变，通用电气也在积极响应，不断开发新的试剂和软件。他们的研发小组曾改造了带GFP融合蛋白的细胞，以作为探针。据Thomas介绍，这些GFP探针相当灵敏，可用于查看细胞的细节，如细胞周期的变化。“这些工具的开发补充了仪器的力量，”他补充道。

研发小组的另一个方向是让药物开发人员和科研人员能够了解单个细胞随时间的变化。许多药物作用于线粒体，这对于心脏细胞或肝细胞而言可能损害较大。这两个器官都有着很高的能量要求，需要带许多线粒体的细胞。Thomas认为，线粒体是高内涵成像的一个理想目标，让研究人员能够在较大的药物浓度范围或较长的治疗时间内观察线粒体的形态或完整性。

GE有两种IN Cell型号。一个带有CCD照相机及500万像素的成像芯片。它让用户能够在低倍物镜下观察广泛的区域，从而让每幅图像中的细胞数量最大化。Thomas表示：“由于用的是高像素照相机，您仍有足够的分辨率来进行图像分析。”另一个型号则用的是CMOS照相机。再结合以激光为光源的可变光阑线扫描，满足了共聚焦成像的需求。此外，实验中每个荧光通道的成像从宽场到共聚焦范围内连续可调，让用户可以充分控制成像速度和图像质量。

Thomas认为，这样的安排能够让研究人员更高效地开展实验。举个例子，一位研究人员正在开展四色分析，仅仅一个通道需要共聚焦，以便详细观察线粒体。那么，共聚焦可限制在红色通道，而蓝色、绿色和橙色通道关闭。这样，他就能节省大量的时间。有了这台仪器，用户只在需要的时候共聚焦，而不会让成像速度受到影响。Thomas相信这一灵活的功能让IN Cell Analyzer 6000与众不同。

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真的从一个细胞中获得DNA和RNA数据？这虽然有难度，但随着各种技术的不断发展，相信这一梦想将会很快实现。（生物通 余亮）

参考文献

1. Shalek, AK, Satija, R, Adiconis, X, Gertner, RS, Gaublomme, JT, Raychowdhury, R, Schwartz, S, Yosef, N, Malboeuf, C, Lu, D, Trombetta, JJ, Gennert, D, Gnirke, A, Goren, A, Hacohen, N, Levin, JZ, Park, H, Regev, A, “Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells,” Nature, 498(7453):236-240, 2013.

延伸阅读

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