PacBio RS第三代单分子测序系统全球访谈纪要（五）[心得点评]

主题五：PacBio的未来方向以及为测序带来的变化？

第三代单分子测序技术PacBio未来会朝着哪个方向升级？它将为测序带来哪些变化？生物通收集了众多声名赫赫用户的看法，为您奉上这一期的全球访谈纪要。PacBio公司的高级管理人员也发表了他们的看法。

主题五：前景：PacBio的未来方向以及为测序带来的变化？

• PacBio系统的已有升级和表现效果

Jonas Korlach：

2012年第三季度，PacBio推出了Magbead自动化上样系统。MagBead自动上样系统可以实现仅用1微克DNA样品构建10 Kb文库，起始量只有之前的1/5-1/10。这个自动化系统可以用于片段纯化，同时又是大片段上样的便捷方式。用户们也清楚，样本准备工序一直是测序质控中的决定性因素，自动化除了省时省力外，更关键的是它还可以大大提高测序质量。

2012年11月初，PacBio发布了XL试剂和软件包，可以将平均读长延长到5000 bp。PacBio为XL试剂的使用提供了两种选择。一种选择是用XL Binding Kit和C2 Sequencing Kit作一个组合。XL Binding Kit中包含的DNA聚合酶比C1和C2拥有更多的改良突变，这些改良一方面使酶的合成速率提高（3 Base/sec vs. 2.5 Base/sec），另一方面使酶对抗光损伤的能力提升。另一种选择是同时用XL Binding Kit和XL Sequencing Kit，这种组合下平均读长可以突破5000 bp，但缺点是正确率比第一种组合略低，我们正在优化软件进行进一步改善。XL试剂盒同时还升级了通量。用2x55 min Movie模式每个SMRT Cell可以得到200-250 Mb数据量，用1x120 min Movie模式每个SMRT Cell可以得到160 Mb数据量，相比C2提高了一倍。

在2013年上半年，PacBio计划提供局部硬件升级，将通量提高至每个SMRT Cell约产出500 Mb数据量。通量再次翻番的实现是通过对150000个ZMW同时进行数据采集，而非之前仅针对75000个ZMW。同时我们还在深入研究抗光损伤DNA聚合酶，这将进一步提升读长和通量。新的试剂盒有望在2013年底上市。

相应地我们也进行了分析软件更新，除了微生物碱基修饰自动分析软件外，PacBio在2013年上半年发布了SMRT Analysis 1.4，并共享到DevNet上。SMRT Analysis 1.4中包含一个新的基因组层次组装流程，称为HGAp（Hierarchical Genome Assembly process），可以实现完全用PacBio的长读长数据对微生物或真菌基因组进行de novo测序和组装，不再借用混合拼接的方式。同时还包含一个新的Consensus Reading（Base Calling）算法，称为Quiver，可以把测序准确率进一步提升至99.999%以上。

这一系列的已有更新将会悉数被加州大学 Davis分校的科研人员采纳，用于对包括沙门氏菌（Salmonella）、弯曲杆菌（Campylobacter）、大肠杆菌（E. coli）、弧菌（Vibrio）和李斯特菌（Listeria）等在内的100000多种致病菌样本进行基因组测序，也称为100K食源性致病菌基因组项目（100K Foodborne Pathogen Genome Project，简称100K基因组计划）。长读长、高度一致的精确性、以及对GC含量或基因组序列无测序偏好，这些特点使SMRT测序技术能够以无预先假设、无偏向性的方式构建完成基因组。

Michael Schatz：
 
在水稻基因组de novo测序项目中，我们率先尝试了XL试剂，在得到的9X覆盖度的长读长数据中，有50%的读长都超过了4800 bp。“与末端配对测序和ALLPATHS-LG组装结果相比，XL贡献的长读长使Contig连续性提高了一倍。”我们之前用Illumina获得的Contig N50值为16 Kb，但加入PacBio长读长数据后，N50一下提升至25 Kb，按照PacBio的发展趋势，很快就能获得兆级大小的Contig，甚至于可以把植物染色体序列直接兑换成单条Contig。

“一开始之所以额外引入Illumina数据是因为三代长读长数据的覆盖度不够，所以无法用PacBio数据进行自我组装，不得已只能采取混合拼接的方式。不过我们正在设法使PacBio的长读长覆盖度翻番，寄希望于仅用自我纠错过的长读长数据就能实现完美的组装方案。”我们研究组还在继续攻关水稻基因组De novo组装课题，在样品准备和组装方法优化等环节上寻找突破口。这个基因组同时还在用BAC-by-BAC和Sanger法进行测序，参考测序结果可以为长读长组装正确率提供评估标准。这还只是测试项目，我们的最终目的是，“用PacBio指导并改善及其庞大又复杂的小麦基因组拼接和草图绘制工作”。

注: 详情请见生物通往期文章1/2。

Eric Antoniou：
 
在470 Mb水稻基因组测序项目中，我们使用PacBio的MagBead上样系统和XL试剂，发现读长显著增加，“即使用XL试剂下最短的读长都要超过之前使用C2试剂下的最长读长，而XL试剂下的最长读长达到了26404 bp”。

注: 详情请见生物通往期文章1/2。

J. Craig Venter：
 
“通过最近的软件更新，PacBio RS系统可以产出超长读长并实现超高精度的从头组装，这极大地改善了我们的发现能力，以便更经济高效地获得新型基因组信息。”

注: 详情请见生物通往期文章1/2。

Marc Allard：

100K基因组项目是2012年由加州大学Davis分校、安捷伦公司和FDA共同发起的，旨在通过基因组测序与分析建立一个公开的致病菌遗传学数据库，来应对食品安全问题引发的忧虑。“为致病菌提供单一完整的基因组是至关重要的，FDA选择PacBio RS系统就是为了能迅速实现细菌基因组图谱的完整化。”

注: 详情请见生物通往期文章5。

Bart Weimer：

建立诸如100K基因组计划这样的泛基因组测序项目的意义是十分重大的，它将有助于更好地“分析爆发源的基因构成，当疫情爆发时，我们就可以更全面地获悉信息并作出判断，是否分离出来的爆发菌株对应已有的疫情还是全新的疫情。

“SMRT测序技术生成的完整基因组将对这一数据库做出宝贵的贡献，为人们提供更多的生物学信息，帮助人们发现新的生物标记物，并为食源性致病菌检测提供参考基因组。原因在于，微生物基因组的特点非常多变，如果没有一个可靠的de novo从头测序和基因组装配的途径，就很难检测微生物基因组的变异，这包括结构变异以及可移动元件、噬菌体或质粒的获取和丢失。更何况微生物基因组的变异对于食品安全又有很重要的影响，把握变异就成为选择测序方案的首要依据。”

注: 详情请见生物通往期文章5。

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• PacBio系统的未来升级方向

Jonas Korlach：

我们的策略基于尽可能地减少DNA聚合酶的光损伤，这是影响读长因素中最主要的一个。目前而言，读长主要受限于DNA聚合酶和荧光染料的间歇性相互作用。“每过一会儿，负责产生光信号的荧光染料总要和DNA聚合酶相互接触并发生作用，光能量会顺势转移过来‘侵蚀’DNA聚合酶，每接触一次侵蚀一次，到某个极限值就会终止测序过程。”光侵蚀某种程度上跟距离或接触程度相关。“所以我们的策略就是让荧光染料和DNA聚合酶分开些，以便最小化光侵蚀效应。”我们已经在试验一种新型改良的聚合酶，这个酶在构象上有一个类似盾牌的遮光保护折叠，从初期数据看还比较乐观, 可以实现平均读长超过9 Kb，单个SMRT Cell数据产出超过1 Gb。

Stephen Turner：

PacBio公司和美国东北大学从NHGRI获得82.5万美金，为期3年，用于研究如何在PacBio RS系统上减少DNA起始量并缩减测序费用。这个项目将把Wanunu于2010年发表在Nature Nanotechnology上的电场控制法应用到SMRT测序的DNA上样过程中，形成一个纳米门控系统，“当有一个DNA分子落入后，ZMW孔的门会关闭并阻止其他DNA分子进入”。“现阶段我们不得不靠扩散法上样（Magbead自动化上样系统除外），依赖基于泊松分布的随机落入方式，有时我们在一个ZMW孔中仅看到一个DNA分子，有时可能没有或超过一个，很明显这个方法的产量不高。所以如果ZMW孔有个控制的门，我们就可以做到让每一个ZMW孔都能有效获得一个DNA模板，这样每个测序单元都能产出数据。”这个办法最直接的效果是使测序通量提高至3倍。
 
静电门控法同时还可以有效降低DNA上样量。“电驱动可以实现远距离DNA上样，还可以兼容低浓度DNA，最终的DNA上样量可以减少至几百至1000倍。”能够利用有限的DNA样品将使PacBio系统的应用得到拓展。“比如它可以进行癌症活组织样品测序而不需要太多DNA，或者更经济地使用仪器获得更多的覆盖度，还有其他诸如法医取证和考古鉴定等应用，有了门控法的帮助这些都可以实现。”
 
对于我们来说，Wanunu发明的静电门控法还有其他潜在用途，比如可以对单个特定的DNA模板进行分配控制。“在模板群中指定一条特定的DNA分子，让它到达某个ZMW孔进行测序,这完全又是另外一种我们想采用的模式。”

Meni Wanunu：

门控的方法需要在ZMW孔的底部嵌入一个纳米孔。“如果你把ZMW看作一个孔，需要每个ZMW孔仅容纳一个单分子模板，那么我们的办法是在里面放一个更小的孔（直径是原先的1/50），就可以使单分子上样率从之前的37%提高到100%。每个ZMW孔是有使用寿命的，你总是希望物尽其用，如果没有DNA落入其中ZMW就被空耗了。所以门控法通过提高ZMW利用率能够显著降低测序费用。”

Stephen Turner：

美国NHGRI于2012年9月14日对外宣布已注入1900万美金用于鼓励发展一系列新的研发项目，希望将DNA测序费用进一步降低。其中英特尔公司（Intel）、PacBio公司、荷兰屯特大学（University of Twente）、哥伦比亚大学组成的研究团队因此获得了NHGRI授予的500万美金，为期4年，用于研发基于电化学标记DNA碱基的单分子实时测序仪。“这是我们灵光一闪想到的，可以把Intel公司和PacBio公司现有的独门绝技结合起来发挥威力。”

“我们正研究采用4种具有区分度的电化学标签作为追踪手段，来记录SMRT测序过程中对应核苷酸掺入DNA链的过程，即记录电信号而非荧光信息。我们将用电化学追踪法替代现有的光学追踪法，这样就不需要分光技术了。”这种技术的优势是不再依赖复杂的光学系统，而通过氧化还原循环反应放大信号，在电路上可以采用互补型金属氧化物半导体（CMOS），因而有望让仪器在整体尺寸上能够灵活控制，可以简化系统并最终缩减测序费用。同时加入这个研发项目的还有哥伦比亚大学和荷兰屯特大学，他们分别擅长电路设计和单分子物理混合。

“但目前我们与Intel公司等的合作还处于探索性的研究阶段，现在就谈换代升级还为时过早。”对于PacBio公司自身的研发倾向而言，还是会把重心放在继续整合荧光追踪和光学系统上。2012年夏天，我们与比利时非盈利纳米电子学公司Imec开始合作开发微芯片，Imec公司的优势是开发紧凑型单片集成设备，我们合作的目的是“将现有SMRT荧光追踪平台进行集成小型化，以便降低费用并进一步提升性能和速度”，目前的进展让我们感到“非常满意”。

Madoo Varma:

“这个项目终于开始动手了，我们很兴奋，也很荣幸能与NIH和四路团队携手合作。”事实上，Intel公司内部很早就在为DNA测序相关的研发工作蓄劲，今年早期我们公布了一项早期成果，用改良版的场效应晶体管装置和电化学标签法记录DNA聚合酶反应。“理想情况下，单分子边合成边测序反应完全可以做到大规模并行，DNA聚合酶的体外合成效率可以高达1毫秒/碱基。但要达到同样目的，光学系统就需要设计得非常复杂，前提需要有效收集光子能量，从而导致高密度检测实现起来不那么容易。要克服光学技术壁垒，最有前途的方式是把生物现象转化为电信号来检测。”

Edwin Hauw：

“单分子实时测序结果分析无需投入复杂又昂贵的软硬件设施，这无疑将为客户提供很大的灵活性，真正意识到PacBio RS系统的潜力。通过和Cycle Computing公司合作，充分利用他们在云计算方面的专长，我们将建立一个可以不断扩展的、高性能的云端数据分析系统，我们的目标是为客户提供性能和便捷性之间最佳的平衡。”

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• 总裁展望

Michael Hunkapiller：

在2012年第一季度，PacBio着手为早期安装客户逐一升级至C2试剂，其结果是“极大提高了仪器的产出性能和数据可靠性”。之前声称遭遇问题的客户在升级后普遍反映这是“实质性的改善”，包括SMRT Cell的数据产出量也有提升（计划到2014年提升至现有水平的45倍），并因此加大了仪器的使用频度。

我们仍然会“把提升已有客户的使用经验放在首要位置”，之前我们也做的很到位，从不断攀升的耗材定点就可以看出来，说明“我们的客户已经抓住了PiaBio的价值精髓，并开始不惜投入了”。“正是这些客户将最终成为我们最好的销售向导，而PacBio的独特价值将逐渐引导客户进入下一轮订购潮。”

接下来，我们也非常希望早期客户能用PacBio技术获得瞩目的成就，可以通过发表或其他公布的方式分享他们的研究成果，用客户的成功去为我们赢得更多地理性支持。同时我们还在不断改进测序工作流程，主要体现在样品准备和分析方法环节，“以定制的方式支持特定的应用，如微生物de novo测序、混合拼接、复杂区域的靶向重测序等”。通过这种“一应俱全的应用解决方案”模式，去赢得那些“拿来就用的的非技术热衷者”的亲睐。

PacBio并没有把第二代高通量测序作为直接的竞争对手。“我们把它们看做同伴，可以在诸如混合拼接等应用场合相辅相成，客户自行决定各取所需。”

（当被问及是否准备出新款仪器替换PacBio RS）“仪器换代还为时过早，有很长一段路要走。我们现在所说的‘升级’都是旨在增强现有仪器的性能，比如有些通过软件、有些通过简单的硬件升级、大部分是应用试剂盒和生物信息学工具的开发，然后我们把这些东西都整合进现有的仪器平台上。我们认为现在仪器的性能已经比几个季度前有了实质性的提升。当然我们也充分考虑到了现有仪器平台的使用期限，但现在还远远没到这个时间点。”

（针对BGI欲并购Complete Genomics一事）“我们不会走这条路的。我们目前不缺现金流，即使按照当前烧钱的速度，这些现金流完全足够支撑到2014年年中。我们也还有其他融资渠道，如果我们认为今后需要的话。我们的基础已经搭建好了，装机量也在攀升，我们也拥有了一些铁杆用户，PacBio技术对于他们正在做的一些科研项目具有不可替代性。从长读长角度而言，PacBio仍然是独一无二的。我们还在不断推进PacBio的通量，以期从这个方向累积PacBio的未来期望值，这一天一旦到来，就是我们开始全方位抗衡其他技术的时候。我们必须不断付诸实施，但我们认为一定可以做到，对此我们非常自信。”

10-15年后，随着技术的成熟以及市场的壮大，第三代测序将最终取代二代测序。“我相信15-20年前，很多人会认为Sanger测序法是个巨大突破，这个方法怎么也不会过时。然而随着二代测序法的价格越来越亲民，Sanger法就迅速落幕了，可能马上就要退出历史舞台。三代测序法如今所处的位置就如同2000年代二代测序法所处的位置一样。”

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• PacBio亚洲代理和测序服务公司

Ken Tominaga：

我们有幸能成为了PacBio在日本的独家代理，如今，日本已经有7台PacBio装机量。“单分子测序是个非常有前景的技术，我们相信日本生物界对该技术的感兴趣程度还会与日俱增。”

Cheung To：

“我们非常荣幸能成为PacBio公司在中国大陆和香港的独家经销商，也非常期待能把这一突破性的创新技术带入中国。PacBio RS系统正为我们展开全新的视角，我们同时盼望SMRT 技术能为中国测序界带来前所未有的悸动。”

Chen Shilin:

我们购买的PacBio单分子测序仪是亚洲第一台。“我们计划将PacBio RS系统用于揭示药用植物及其病原体的遗传结构，最终实现有效保护、开发、利用药用植物资源的目的。”在未来还将对外提供商业化三代测序服务。

Jong Lee：

DNA Link已经在韩国安装了一台PacBio，从而成为亚洲第一家提供商业化三代测序服务的公司。“单分子测序技术即将开启测序应用的新纪元。”

Georg Gradl：

之前我们在多个项目中“十分仔细地检测过”PacBio的性能，这些项目包括细菌、真菌和高等植物基因组测序。“我们同时希望，结合我们多年来在de novo测序领域的知识、技能和经验积累，能最终为三代测序技术的改善提高作出应有的贡献。”我们公司在欧洲、美国和亚洲设有多个办事处，并在2011年5月正式开始对外提供三代测序服务。

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生物通往期文章

1. PacBio RS第三代单分子测序系统全球访谈纪要（一）
2. PacBio RS第三代单分子测序系统全球访谈纪要（二）
3. PacBio RS第三代单分子测序系统全球访谈纪要（三）
4. PacBio RS第三代单分子测序系统全球访谈纪要（四）
5. PacBio助力100K基因组计划 从头解密10万种食源性致病菌

近期相关会议推荐

为全面总结疾病遗传学和基因组学研究进展，探讨后GWAS时代疾病发病机制研究的机遇与挑战，推动转化医学发展，兹定于2013年5月16-18日在上海举行第三届《自然遗传》疾病基因组学国际研讨会（Workshop）。

论坛由《Nature Genetics》（《自然遗传》杂志）联合安徽医科大学，上海交通大学和复旦大学共同主办，Myles Axton博士与张学军教授共同任执行主席。论坛主题是“From GWAS to Precision Medicine”，主要围绕复杂疾病的发病调控表达研究，复杂疾病全基因组关联研究meta分析，复杂疾病表观遗传学研究，全基因组外显子测序搜寻疾病遗传变异及转化基因组学研究。

论坛将邀请来自《自然遗传》、美国哈佛大学、美国华盛顿大学、美国科罗拉多大学、英国伦敦大学、英国邓迪大学、新加坡国立大学，中国医学科学院、上海交通大学、复旦大学、浙江大学、同济大学、中山大学、中南大学及第二军医大学等国内外相关单位权威学者参会。PacBio公司创始人兼首席科技官Stephen Turner先生受邀参会，将在会议期间分享PacBio RS系统特有的单分子实时测序（SMRT）技术在后GWAS时代的创新应用。

报告题目：Extremely Real Long Reads Using SMRT Sequencing as a Follow Up to Post-GWAS Candidate Regions

报告人：Stephen Turner, Founder & CTO at Pacific Biosciences

报告时间：12:50-13:50, 2013/05/17

报告地点：上海浦西洲际酒店（恒丰路500号）3楼豪华宴会厅 （即第三届《自然遗传》疾病基因组学国际研讨会会场）

Abstract:
Pacific Biosciences Single-Molecule Real Time DNA sequencing technology provides the longest readlength of any sequencing technology, with consensus accuracy equal to or higher than any other technology and at a per-run price lower than any second-generation system.  These qualities, coupled with our DNA barcoding/multiplexing methods make it ideal for following up on leads generated by GWAS or second-generation sequencing.  I’ll survey a selection of projects that highlight these benefits including applications in cancer biology, HLA typing, repeat expansion analysis, and haplotype phasing.  With the recent release of the RS II (and its associated upgrade for existing instruments), throughput with targeted amplicons can be as high as half a gigabasepair per 2-hour run, leading to a powerful and economical tool that permits examination of the full range of heritable features found in DNA from accurate SNP calls to haplotypes to repeat expansions and structural variants.  I’ll finish with a perspective on the future of amplification-free targeting of genomic loci so that epigenetic marks can be examined at the same time.

会议网址：http://www.natureasia.com/en/events/gwas-2013/