荧光定量PCR选择多

生物通报道：荧光定量PCR（qPCR）是以荧光为基础的定量分析技术，应用非常广泛，可以用于定量RNA的丰度（RT-qPCR），验证芯片或测序的数据，确定病原体的载量，进行基因分型等等。

荧光定量PCR仪负责监控反应体系中荧光强度的变化，记录检测荧光达到阈值时的循环数（被称为Ct或Cq值）。从理论上说，每一个qPCR循环会使目标序列翻倍，因此人们可以在Ct值的基础上对样本进行定量。

在进行荧光定量PCR时，我们往往会面临众多选择，每一步选择都影响着实验的最终结果。好在市面上的qPCR产品也种类繁多，可以满足我们的各种需求。

染料法VS探针法

荧光定量PCR主要分为染料法和探针法两种。染料法一般采用DNA染料SYBR® Green（或Promega的BRYT® Green等），这种方法不仅使用简单，成本也最低。不过染料法检测的是体系中的所有双链DNA，不具有序列特异性。为此，一些厂商提供ROX作为内部荧光参考标准，用来校正背景。

染料法

成本低是染料法qPCR的一个主要优势，DNA染料相对比较便宜，而且适用于任何序列。不过染料法无法在同一个样本中检测多个指标，也难以鉴定扩增得到的序列，会受到脱靶效应（如引物二聚体）的影响。在这种情况下，就需要进行熔解曲线分析，判断扩增所得产物是否只有一种。

据安捷伦的Surekha Karudapuram介绍，熔解曲线分析能够帮助研究者确定扩增的特异性。她还指出，理论上利用熔解曲线也可以进行多染料的反应，甚至可以粗略定量那些峰值。

市面上可供选择的染料法master mix非常多，例如：安捷伦的Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green QPCR & QRT-PCR master mixes，Bio-Rad的SsoAdvanced™ SYBR® Green Supermix，Life Technologies的SYBR® Select Master Mix，Promega的GoTaq® qPCR Master Mix，Qiagen的Type-it CNV SYBR Green PCR Kits，罗氏的FastStart SYBR Green Master，Sigma-Aldrich的KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™，以及Thermo的Luminaris Color HiGreen High ROX qPCR Master Mix等等。

TaqMan探针

探针法qPCR使用具有序列特异性的荧光寡核苷酸探针。目前最常用的是Life Technologies公司的TaqMan®探针，该探针5’端连有荧光基团，3’端连有淬灭基团。在反应进行时，探针与正反向引物之间的模板结合，当聚合酶到达探针处时，酶的5’-3’外切活性将荧光基团切下，使其脱离淬灭基团，发出荧光。

探针法与染料法的最大区别在于，理论上探针法中的荧光信号只来源于目标序列。此外，人们还可以利用不同探针，在一个体系中同时检测多种指标。

市面上的探针法master mixes也是琳琅满目，包括：安捷伦的Brilliant III Ultra-Fast QPCR & QRT-PCR Master Mixes，Bio-Rad的SsoFast Probes Supermix，Life Technologies的TaqMan Fast Advanced Master Mix，Promega的GoTaq Probe qPCR Master Mix，Qiagen的Type-it CNV Probe PCR +qC Kit，罗氏的FastStart TaqMan Probe Master，以及Thermo的DyNAmo ColorFlash Probe qPCR Kit等等。

据估计，SYBR Green或TaqMan的使用者占qPCR用户总数的80-90%，其他用户采用的也基本上是上述两种方法的变种，例如分子信标和Scorpion®探针。

其他探针

分子信标是一个发夹结构的DNA探针，两头分别带有荧光基团和淬灭基团。与TaqMan一样，分子信标的序列也与扩增引物之间的模板互补。在退火阶段，这种探针的发夹结构展开与模板结合，这时荧光基团与淬灭基团分开，发出与模板丰度相对应的荧光信号。Scorpion探针将分子信标与PCR引物结合起来，在扩增阶段引物延伸形成PCR产物，产物中的序列能够与探针互补结合，使探针发夹结构打开，发出荧光。

此外，Promega还开发了一种新型的Plexor® qPCR系统。在Plexor系统中，引物含有经修饰的核苷酸（iso-dC）和荧光基团。随着扩增的进行，DNA聚合酶会向DNA链中引入荧光淬灭基团，使体系中的荧光逐渐减弱。其他qPCR方法记录荧光的增强，而Plexor记录的是荧光的衰减，Promega的市场经理Gabriela Saldanha解释道。

据Saldanha介绍，Plexor将探针法的序列特异性，与染料法的熔解曲线分析结合起来。“你可以验证目标扩增的特异性，”她说。此外，Plexor检测不同靶序列只需要两种引物，使多重分析的设计更为容易。

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基因表达分析

从SNP分型、拷贝数分析到病原菌检测，qPCR应用范围非常广，不过最常见的是用qPCR进行基因表达分析。基因表达分析往往需要定量样本中的特定RNA，例如mRNA、microRNA、或长非编码转录本。进行这样的分析，首先要将RNA转变为可以扩增的DNA，进行cDNA合成。

RT-qPCR试剂盒主要分为一步法和两步法。一步法试剂盒将cDNA合成与qPCR合并为一步，速度更快，也更适用于自动化流程。两步法虽然需要进行两次反应，但反应的效率更高，而且可以允许用户保留cDNA样本，能够在一个RNA样本中检测多个转录本。

“两步法（qPCR）更有优势，其cDNA合成和qPCR反应的效率更高，”Saldanha说。安捷伦，Bio-Rad，Life Technologies，Promega，罗氏和Qiagen都提供有相应的RT-qPCR试剂盒。

样本的挑战

荧光定量PCR结果的好坏往往取决于核酸制备的质量。处理环境样本（如土壤）和植物样本比较困难，因为其中往往含有抑制PCR反应的物质。此外，FFPE样本也较难处理，其中不仅有PCR抑制剂，样本中的核酸可能也遭到了降解。

“这种情况对于灵敏度要求较高，因为模板量非常少。”Karudapuram说，“需要提取更纯的核酸，并且使用能扩增少量初始模板的master mix。”我们可以选用进行了相应优化的核酸提取试剂盒，例如Promega的ReliaPrep™ FFPE RNA Miniprep System或者Life Technologies的Plant RNA Reagent等等。

选择理想的qPCR扩增引物，也是一个不容忽视的问题。专家认为，对于相同基因的检测，最好采用已经标准化了的引物。目前，不少供应商都为研究者们准备了预先设计好的qPCR文库，例如Sigma-Aldrich公司就制备了人类、小鼠、大鼠和斑马鱼的文库。此外，Qiagen，Life Technologies，和Thermo等公司也提供有类似的工具。

qPCR仪与数字PCR

从本质上来讲，荧光定量PCR仪就是PCR仪与荧光检测仪的结合，用于记录qPCR反应时产生的数据。市面上的qPCR仪主要有以下几种：安捷伦的Mx3000P qPCR System，Bio-Rad的CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System，Illumina的Eco Real-Time PCR System，Life Technologies的QuantStudio™ 12K Flex System，Qiagen的Rotor-Gene Q，罗氏的LightCycler® systems，以及Thermo的PikoReal Real-Time PCR System等。

荧光定量PCR已经是一个相当成熟的技术了，不过当样本间的绝对差异较小时，qPCR检测的效果并不那么理想。例如，qPCR很难区分一个基因两拷贝和三拷贝之间的差异。好在，能够进行绝对定量的数字PCR技术诞生了。

数字PCR将样本分为许多份，使每一份包含零或一个拷贝的模板。然后在每一份样本中运行qPCR反应，对呈阳性的孔进行计数，以此确定样本中模板分子的绝对数量。这一技术的精确性非常高，可以区分很小的拷贝数差异。Bio-Rad、Fluidigm、Life Technologies和RainDance是目前几家主要的数字PCR厂商。

 

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（Jeffrey M. Perkel撰写/叶予编译）