创新参选：光可控的基因表达系统

研究人员经过潜心研究，发明了一种光调控的基因表达系统-LightOn系统，利用可见光来激活目的基因的表达。这一过程无需加入对环境有污染的诱导剂，也避免了潜在的毒性，更重要的是，利用光可以特异性的从空间上调控基因的表达。

　　生物通报道：“赛默飞之生物通2012实验室创新技术大奖”评选活动开展以来，生物通已经陆陆续续收到不少项目，这些项目中有的能减少实验步骤，有的能降低实验成本，还有一些改进了实验设备，让我们的实验过程更加轻松。

参选项目：光可控的基因表达系统

背景：

基因表达是生命的最本质特征之一，基因表达的调控对于研究生命体的各种生命生命活动是至关重要的。基因表达系统可分为组成型基因表达系统和诱导型基因表达系统，前者基因的表达是随时随地不受调控的，而诱导型基因表达系统可以精确调控基因表达开启/关闭的时间及表达水平。目前世界上已经有很多种化学物质诱导的基因表达系统，然而化学物质无法特异地对专一细胞或组织进行调控，限制了其应用范围。

然而，光是一种易于进行时间和空间操作的诱导物，一般对细胞无上述毒性，廉价易获取且绿色环保，更重要的是可以高时空分辨率精确调控基因的表达，因此开发一个利用光作为诱导剂的基因表达系统是非常具有经济和科研价值以及社会意义的。然而，现有的一些方法方法由于技术的复杂性与局限性很少得到应用。

我们经过潜心研究，发明了一种光调控的基因表达系统-LightOn系统，利用可见光来激活目的基因的表达。这一过程无需加入对环境有污染的诱导剂，也避免了潜在的毒性，更重要的是，利用光可以特异性的从空间上调控基因的表达。这种空前的技术将弥补化学诱导表达系统的缺陷，有助于生命研究中一些复杂的生命现象的解释，也有可能为基因治疗提供一种有利的工具。

LightOn系统是利用蓝光来激活外源基因表达的一种分子生物学工具。它具有如下特点：

1. 其诱导剂是蓝光，对人和动物是安全的，对环境是无污染的；
2. 在非诱导状态下，本底表达水平低；诱导后激活水平高，激活倍数可达200多倍，在很多哺乳动物细胞中的表达水平与CMV启动子接近；
3. LightOn系统的基因表达量是易于调节的，依赖于光照量的；
4. 其各个元件来自酵母和真菌，与哺乳动物无同源性，不会对宿主细胞内源细胞通路造成干扰；
5. LightOn系统激活的目的基因的表达是可逆的，去除光照后目的基因的表达可以关闭；
6. 最重要的是，LightOn系统可以在空间上调控目的基因在哺乳动物细胞和小鼠中的表达。

该技术不仅在国内上是首创的技术，在国际上也处于领先水平。在我们的研究开展之前，没有任何一种基因表达系统既有良好的诱导性质，又能够在空间水平上调控。LightOn系统填补了这一技术空白，给很多研究者提供了一种理想的研究工具。在未来的生命科学研究的各个领域，均有极大的应用价值。

该技术已经以论文形式发表于顶级杂志《Nature method》(影响因子=20.7)，题目为“Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system”。本发明的指导教师杨弋教授，同时该技术被自然旗下著名杂志《Nature review molecular cell biology》（影响因子=38.65）进行了亮点报道。该技术被同行评价为“种子性技术”，文章发表以来来，已有来自美国哈佛大学、斯坦福大学、麻省理工大学、加州大学、英国剑桥大学、牛津大学等60多个研究组来信寻求该技术。

方法改进：

本系统是由单一的、人工合成的对蓝光有反应性的光敏转录因子组成。在光照的条件下目的基因的表达“开启”，而在黑暗条件下目的基因的表达则会“关闭”。与之前的商业化系统相比较，该系统主要有以下改进:

1. 更过去之不能。
(1) 该系统可以在空间上精确调控目的基因的表达。之前的系统中化学小分子诱导物易扩散，很难在空间上对基因的表达进行调控；
(2) 该系统具有很好的可逆性。化学小分子诱导物一旦加入很难去除，除非更换新鲜培养基；
(3) 该系统可以用来进行光动力学治疗一些疾病的研究；

2. 实验结果更好。
(1) 该系统具有极低的本底表达和很高的诱导倍数。该系统的诱导倍数可以达到200倍以上，并且非诱导状态下的本底表达极低。这比很多的化学诱导表达系统都要优秀，让很多要求比较高的实验结果更好。
(2) 该系统可以很容易的利用不同的光照强度来控制目的基因处于不同的表达水平上，满足科研者的不同需求；

3. 节省实验经费。
相对于之前昂贵的化学诱导物，光是非常廉价易获取的，并且现在的LED灯非常节能，其能耗仅为白炽灯的1/10甚至更少。我们系统中使用的蓝色LED灯的功率只有9 W，持续光照100多个小时才耗1度电，因此可以节约大量的实验经费。此外，简单的按开关也节约了用来加化学诱导物的一次性耗材的费用。

4. 节约时间
该系统是利用蓝色LED灯来控制目的基因表达的“开”与“关”，因此只需要按一下电源按钮即可诱导目的基因的表达与否，而之前的系统需要打开培养皿加入诱导剂，此过程操作繁琐且浪费时间。因此，该系统可以节约时间，让科研者有更多的时间去做其他的事情。

结果：

本系统是由单一的、人工合成的对蓝光有反应性的光敏转录因子组成。在光照的条件下目的基因的表达“开启”，而在黑暗条件下目的基因的表达则会“关闭”。我们称这个光敏转录因子为“GAVPO”。

我们的光可控基因表达系统不需要特别的装置，只需要从淘宝网店上去买一个蓝色LED灯，然后装在普通的细胞培养箱上即可（图1）。

图1 光可控基因表达系统使用的培养箱示意图

LightOn系统是一种光调控的真核细胞基因表达系统，由两部分构成，一部分是蓝光调控的转录激活因子，另一部分是受该转录激活因子调控的含有目的基因的靶转录单元。在黑暗条件下，转录因子GAVPO不与靶转录单元结合，目的基因不表达；蓝光照射后，GAVPO发生二聚化从而结合到靶转录单元中的UASG序列上，激活了目的基因的表达（图1）。

图2. LightOn系统原理工作示意图

我们用哺乳动物细胞来研究了LightOn系统的性质，发现LightOn系统在黑暗条件下具有很低的本底表达水平，光照后能够迅速激活目的基因的大量表达，其激活能力与强启动子CMV启动子相当，诱导倍数高达200多倍（图3）。这样的诱导性质已经远远超过很多化学诱导表达系统。

图3. LightOn系统在哺乳动物细胞中对目的基因的激活作用。

LightOn系统激活目的基因的表达是可逆的，即去除光照后，原本被激活的表达会逐渐停止（图4）。

图4. LightOn系统激活目的基因Gluc表达的时间动力学过程和可逆性研究。

目的基因的激活量依赖于光照量，光照量越大目的基因的表达水平越高（图5）。

图5.LightOn系统激活Fluc表达量与光照量的关系。标尺，0.5 cm。

LightOn系统的另一大亮点是可以实现空间上专一细胞的表达调控。我们采用“光膜片”对光进行空间上操纵，在培养的哺乳动物细胞底部贴上光膜片，经过蓝光诱导及活细胞成像，得到一副与光膜片几乎一致的“细胞影印图像”（图6）。

图6. 利用LightOn系统进行“细胞影印”。左图为贴有光膜片的培养皿，右图蓝色圆圈内为获得的细胞影印的图像。标尺，1 cm。

LightOn系统不仅可以在哺乳动物细胞上使用，还成功的应用于小鼠模型。将LightOn系统导入小数后，可以激活红色荧光蛋白mCherry在小鼠肝脏和肾脏中的表达（图7）。

图7. LightOn系统导入小鼠后，光照激活mCherry基因在小鼠肝脏和肾脏中表达。

进一步的，我们还用光纤将蓝光引入小鼠腹部，对目的基因mCherry的表达进行空间上的调控，结果发现，在肝脏中只有光照的部位mCherry表达，不光照的位置基因不表达（图8）。

图8.利用光纤诱导mCherry在小鼠肝脏中局部表达。

最后我们尝试用LightOn系统来治疗I型糖尿病小鼠，光照激活LightOn系统表达胰岛素基因后，I型糖尿病小鼠的血糖明显降低（图9）。因此LightOn系统将来有望应用于基因治疗领域，为基因治疗领域提供了一种新型的有效工具。

图9. 光照诱导胰岛素（Insulin）在I型糖尿病小鼠中的表达。pGAVPO(C108S)为无转录激活能力的突变体。

 

赛默飞特约之生物通2012实验室创新技术评选活动： http://www.ebiotrade.com/custom/ebiotrade/cxjs-2012/index.htm