专家经验谈：实现完美的哺乳动物细胞培养

哺乳动物细胞培养已经成为科研领域的基础，细胞培养的质量直接决定着实验的成败。本文收集了一些细胞培养的实用技巧和专家心得，希望能够帮你实现完美的哺乳动物细胞培养。

生物通报道：哺乳动物细胞培养已经成为科研领域的基础，细胞培养的质量直接决定着实验的成败。此外，由于动物模型有时并不可靠，制药公司也越来越倾向于用细胞测试药物的安全性。“例如，苯会使人患白血病，但对小鼠就没有这样的效果，”Sigma-Aldrich的市场部经理Don Finley说。“我们不能直接在人体内测试早期的实验性药物，而单靠动物模型也并不理想。”

培养高质量的哺乳动物细胞绝对是个技术活，许多因素都能在不知不觉间影响细胞的状态。本文收集了一些细胞培养的实用技巧和专家心得，希望能够帮你实现完美的哺乳动物细胞培养。

培养基和添加物的选择

培养基的选择取决于细胞的类型和实验的目的，可以说培养基没有“最好”只有“最适”。如果是维持贴壁培养的哺乳动物细胞，一般选择普通的DMEM培养基（Dulbecco's Modified Eagle Medium）。对于非贴壁细胞而言，专门的悬浮培养基更好用。

在选择合适培养基的时候，我们需要先了解细胞系的来源。这样的信息可以从细胞的供应商获取，也可以在文献上查到。此外，欧洲细胞株/微生物保藏中心（ECACC）也为各种细胞系推荐了最适培养基。有些特殊的细胞系，需要用特殊培养基进行培养，例如专门生产蛋白的杂交瘤细胞。“培养基的分工越来越细，人们甚至可以根据特定细胞或蛋白表达的需要来订制培养基，”Finley说，其所在的Sigma-Aldrich是ECACC的经销商。

对于不那么特殊的细胞，人们往往采用普通培养基（如DMEM），并辅之以支持细胞生长的因子。例如，许多研究人员会在基础DMEM中添加胎牛血清FBS。“血清能够提供多种营养物质和粘附因子，”Sigma-Aldrich的市场部经理George Sitterley说。不同细胞对血清的需求量并不相同，因此可以事先对细胞进行测试。“我们建议从10%FBS开始，然后根据细胞活力进行增减，”Rockland Immunochemicals的技术带头人Tabitha Eckert说，该公司以生产抗体为主。“我们倾向于选择含高糖和L-谷氨酰胺的培养基，不同DMEM中这些成分并不相同。”葡萄糖和谷氨酰胺是细胞的能源，不同类型的细胞对这些物质的喜好程度也存在差异。“谷氨酰胺往往很重要，我们可以用含谷氨酰胺和不含谷氨酰胺的培养基进行调配，得到最合适的浓度。”Sitterley说。

有时人们会在细胞培养体系中添加抗生素以避免细菌污染，不过专家认为此举应当谨慎。“有些细胞培养专家认为没有必要使用抗生素，”Sitterley说。“不过，对于我们一般人来说，在短期应用中添加一定量的抗生素是可行的。但最好不要长期使用抗生素，因为一旦细菌产生抗性反而更加麻烦。我们不得不使用更多抗生素，而这会影响细胞的生长甚至杀死细胞。”

培养容器的选择

细胞培养容器一般包括培养板、培养皿和培养瓶，我们可以根据研究方法和细胞量进行选择。单纯对细胞进行扩增可以采用细胞培养瓶。而多孔板可以让我们在培养细胞的同时，对细胞进行光学分析。在用细胞进行药物筛选时，一般需要使用高密度的微孔板。

为了优化抗体产量，Rockland Immunochemicals公司的研究者们很重视细胞培养容器的体积。他们先在培养瓶中培养细胞，然后根据抗体产量选择合适的容器进行扩大培养。“不要总认为容器的体积越大，产量就会越大，”Eckert说。“有时小瓶与大瓶的效果一样好。我们采用的培养瓶一般是TC处理过的，且带有通气盖，这样可以促进细胞贴壁和CO2气体交换。”的确，不同类型的培养瓶具有不同的特点。例如，滚瓶适合大量悬浮细胞生长，能够促进气体交换。“也可以用不透气的滚瓶进行培养，这样细胞自己在其中产生CO2，”Eckert说。“能够培养超过三十天。”

Corning公司的应用经理Mark Rothenberg指出，细胞系的生长特性也不容忽视。在选择培养容器时，应考虑到所需的细胞量、细胞的倍增时间（doubling time）和细胞的理想密度。“可以采用T25cm2到T225cm2的容器，制定成比例放大的细胞培养计划，”Rothenberg说。此外，市面上也涌现出了一批新产品可供选择，例如Corning®的多层培养瓶或HYPERFlasks®。Sigma-Aldrich也正准备发布细胞培养系列，包括TC处理过的培养瓶、移液管、锥形管和冷冻管等。

如果需要对大量细胞进行长期培养，大型的细胞培养系统或生物反应器就很有帮助，它们可以帮你控制多种参数，例如自动控制培养基更换、补料速率和氧气/ CO2水平。“如果需要长期生产大量抗体，我建议使用细胞培养系统，”Eckert说。“我们现在使用的是Wheaton的CELLine™生物反应器，它可以放入标准培养箱，和培养瓶一样好用。这一系统的优势在于，不需要特殊培养箱，长期使用比其他系统更能节省培养时间。”

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操作建议

基本的无菌操作是哺乳动物细胞培养中最重要的技术之一。此外，维持一个细胞系还需要掌握接种、传代、收获、低温保存和复苏等技术。Rothenberg特别强调了做好培养记录的重要性，他指出培养记录应该包括所有的有用信息，例如细胞系的名称和来源，培养条件，培养基要求，细胞系的照片，细胞系的验证信息和支原体分析等等。

Sigma-Aldrich和ECACC将细胞培养的基础操作汇编成册，“其中包括了细胞培养的许多基本注意事项，”Sitterley说。“对于长期从事细胞培养的人类说，这个手册只是入门的基础读物。不过对于新手来说，该手册提供了许多实用技巧。”

一次操作一种细胞

许多人为了节省时间，往往忽视了这一原则。“在超净台上同时操作几种细胞，很容易造成细胞系之间的交叉污染，”Sitterley说。这往往会令事情变得格外复杂。

细胞系之间交叉污染会混淆细胞系的来源，“实验室中保存的细胞系，至少有35%并不可信，”Finley说。“在开始新研究时，最好能够从ECACC等储藏机构获取细胞。这样的细胞不仅来源确定，而且保证不受支原体污染。”

Sitterley说：“美国癌症研究协会旗下的所有刊物，都要求来稿的研究人员对所用细胞系进行验证。”他举了个例子，尽管张氏肝细胞早已被证实是HeLa细胞，但仍有研究者在用这种细胞进行肝脏研究。

一次只操作一种细胞系，可以避免交叉污染。“HeLa细胞就像野草，”Finley说。“它们在干燥条件也能生存，只要加入培养基就会继续生长，很容易污染。”此外，同时操作多种细胞系，也很容易引入人为错误，这是人类的天性。

冷冻保存

冷冻保存一些细胞以备不时之需，能为研究提供重要保障，避免人为错误造成严重后果。“就算规划得再好，也很难完全避免污染，”Sitterley说。“如果在细胞受到污染前进行过冷冻保存，就不会造成难以挽回的局面。”

对细胞进行长期研究，也需要通过冷冻保存，在实验室建立种细胞库。“将培养的细胞分成若干小份，冻存在细胞库中，”Sitterley说。“研究时取出一份进行扩增即可。”一段时间之后，我们可以从细胞库中取出新一批细胞进行研究，以保证所研究的细胞永远处于同一阶段。不过，这样的细胞库需要保存在液氮中，因为细胞在冰箱里也会随着时间推移而老化。“保存在液氮温度下的细胞，基本保持一致状态，”Sitterley说。“如果保存在-80°C，细胞会发生缓慢变化。”

在细胞培养工作中，经验是非常重要的，因此多练手始终是成功的王道。

 

（Caitlin Smith撰写/叶予编译）