专访张博：两篇Nature子刊技术论文开创同源重组新方法

　　

生物通报道：2011年在我们还不是十分熟悉它的名字的时候，它被评为了当年Nature Methods杂志的年度技术，2012年在这种技术已成功应用于人类体外培养细胞、酵母、线虫、斑马鱼、植物、大小鼠等多个领域之后，它又入选了Science十大科学突破。这就是TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) 技术。对于这种可谓是站在风头浪尖的新型技术，国内学者也相继展开了研究，然而在技术上能获得进展的却不多。

   来自北京大学生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室的张博教授研究组却屡有斩获：2011年在Nature Biotechnology杂志上首次利用TALEN在斑马鱼中成功实现可稳定遗传的基因组定点突变；2013年又在此基础上，发表Nature Methods文章，利用TALEN造成的DNA双链断裂，大大提高了同源重组效率，从而在模式生物斑马鱼中实现了真正意义上的同源重组基因打靶。

   这两篇具有重要意义的技术论文不仅拓展了TALEN技术的应用，而且令同源重组基因打靶摆脱了对胚胎干细胞（ES细胞）的依赖。为了更深入地了解这项最新技术成果的方方面面，生物通特联系了张博教授，就读者感兴趣的问题请教了她。

同源重组效率至少提高几十倍

   关于同源重组，分子生物学等领域的读者肯定不陌生，这是一种利用相似序列DNA重排机制的生物学技术，利用这种技术可以对基因组进行精确修饰，在研究基因功能，构建人类疾病的动物模型，遗传育种等方面应用广泛。

   但是“传统的同源重组方法主要是用于在小鼠ES细胞中进行基因打靶，通常只是通过转染的方法提供DNA供体，主要依靠细胞内自发的同源重组事件。一般来说，在ES细胞中，自发同源重组的效率在百万分之一的水平；当然，考虑到细胞的转染效率，这个数值有一定的低估，但是不会有数量级上的差异。在注射小鼠受精卵的情况下，同源重组效率小于0.2%（Brinster等）”，Nature Methods文章的共同第一作者、张博教授研究组的佟向军副教授解释道，“在斑马鱼中同源重组的效率应该更低，因为在我们的实验中，只注射重组载体（DNA供体）的胚胎几乎检测不到同源重组发生，因而无法像小鼠ES细胞那样进行同源重组基因打靶。”

   为此，张博教授研究组展开了深入探索，他们利用TALEN方法造成DNA双链断裂，大大提高了同源重组效率，从而在模式生物斑马鱼中实现了真正意义上的同源重组基因打靶。

   张教授表示，“前人有工作表明，DNA双链断裂能够提高同源重组的效率。我们的论文就是利用这一原理，通过TALEN提高同源重组的效率，以实现直接在动物个体水平筛选同源重组基因打靶的后代。在我们的实验中，F₀斑马鱼的种系传递的效率为1.5%（从275条F₀中筛选到4条生殖细胞打靶成功的斑马鱼），种系嵌合率平均为12%。不过，由于只注射重组载体时我们在斑马鱼胚胎中从未检测到同源重组事件，因此难以计算同源重组的效率究竟提高了多少倍；根据现有的数据，预计应该至少提高了1~2个数量级（几十倍）。”

   而且除了提高重组效率外，这种方法还有以下优势：

（1）能够按照人们的意愿精确修饰/改造基因组；
（2）实现基因敲入（knock-in）和条件性基因敲除（conditional gene knock-out）；
（3）精确制备模拟人类遗传病的动物模型：很多人类的遗传病是致病基因的错义突变（missense）造成的，用同源重组的方法可以在斑马鱼中造成相对应的基因突变形式，从而在基因水平精确模拟人类疾病。

   此外，跟短片段单链寡聚核苷酸造成的重组修复（Steven Ekker的方法，只能进行小范围修饰）相比，用传统的长双链DNA做同源重组打靶载体至少有以下优点：

（1）能够进行大片段的基因修饰，比如将报告基因（如GFP）整合到内源基因中，或模拟基因较大片段缺失引发的人类遗传病（这种病也有很多）等等；
（2）容易检测随机插入（利用接头介导的PCR或Southern杂交技术），这对于条件性基因敲除尤其重要。因为loxP或FRT这样的短序列插入非特异的位点，有可能引发意想不到的后果，使实验结果难以解释；
（3）由于可以进行大片段修饰，使人们有可能一次性插入两个loxP位点，完成条件性基因敲除；短片段单链寡聚核苷酸的方法要分成两步进行，需要两次筛选，加上养殖时间，会耗费更多的精力、时间和空间。

承前启后的技术成果

   在采访过程中，我们误以为最近发表在Nature Methods的这项成果是首次利用TALEN在斑马鱼中成功实现可遗传基因定点突变，然而其实早在2011年，张博教授就已经开始了这方面的研究。他们在此前的研究中，单独采用一对TALEN，造成靶位点产生DNA双链断裂，利用细胞非重组末端连接（NHEJ）修复时产生核苷酸的小片段缺失和/或插入（indel），从而实现基因的定点突变。

   然而这种突变方式由于无法精确控制indel的类型，因此无法精确控制突变的结果（核苷酸序列）。为了克服这个问题，张教授研究组在最新这项研究中，额外加入了一个长双链DNA，作为同源重组的供体（DNA序列模板），这样就可以通过同源重组的途径，把目的基因精确改造成需要的形式了。

   而且这些研究从理论上说可以适用于任意物种（包括经济作物、大家畜、宠物、灵长类动物等等）以及任意物种的体外培养细胞（包括人类的体外培养细胞）。

   张教授说，“这项技术除了能够应用于生命科学基础理论研究，应该还可以应用于所有依赖于精确修饰/改造基因组的工作，例如，构建精确模拟人类遗传病的动物模型（用于研究病理和筛选药物、评估毒理和药效），改良农作物、家禽家畜的经济性状和育种、保种方式，改造宠物的形态、行为等特征（使其更贴近人类的需求），等等。对动植物本身拥有的内源基因进行遗传改造，以获取人类需要的性状，从理论上说，这样做应该比直接添加外源基因的转基因动植物在安全性上更容意为大家所接受。而对于人类自身，这项技术跟干细胞技术相结合，有可能应用于基因治疗领域，帮助人们修复受损伤的基因，或者破坏不需要的或有害的基因，从而根治某些遗传病或预防某些疾病。”

更多展望……

   关于基因组编辑技术，近期另外一项称为CRISPR/Cas系统的方法也受到不少科学家的关注，为此我们也请教了张教授，她表示，“CRISPR/Cas技术在实验操作上确实比TALEN简单，不过，将这项技术应用于基因打靶是两个月前才刚刚被报道的，我们的工作则是在2011年就开始了。那时，TALEN是刚被报道的一种优于ZFN的、可以随意改造的人工核酸内切酶。

   CRISPR/Cas在基因打靶原理上跟TALEN类似，都是通过造成靶位点的双链断裂，诱导靶基因产生突变。也就是说，CRISPR/Cas跟TALEN一样，应该也可以提高同源重组的效率。或者说，我们这项技术所依据的理论完全适用于CRISPR/Cas技术；理论上，只要将一对TALEN换成Cas9和guide RNA的组合，应该同样可以通过CRISPR/Cas技术实现对任意基因组进行精确修饰。也就是说，我们这项技术应该很容易转化成基于CRISPR/Cas系统的基因组精确修饰/改造技术。”

（生物通：王蕾）

原文检索：
Yao Zu, Xiangjun Tong, Zhanxiang Wang, Da Liu, Ruochuan Pan, Zhe Li, Yingying Hu, Zhou Luo, Peng Huang, Qian Wu, Zuoyan Zhu, Bo Zhang, Shuo Lin,TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish.Nat Methods (2013), Feb 24. doi: 10.1038/nmeth.2374

Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S. and Zhang, B. , Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. , Nat. Biotechnol. , 2011 , 29 (8): 699-700.

作者简介：
张博
北京大学生命科学学院教授

实验室主要兴趣在于：

1 以斑马鱼为模式研究脊椎动物早期胚胎发育基因表达调控与器官形成机制，特别是血液与心血管系统以及胰腺等内脏器官的细胞分化与发育。

2 斑马鱼功能基因组研究。
斑马鱼（Danio rerio）是进行发育生物学研究的理想模式脊椎动物。本实验室以功能基因组研究手段为切入点，通过筛选斑马鱼中与血液、心血管或胰腺发育相关的突变体与基因，鉴定基因的表达图谱，并进行基因功能以及表达调控机制的研究。

（1）新基因的筛选：应用以Tol2转座子为基础的“增强子诱捕”（enhancer-trap）技术、以绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP）为报告基因大规模筛选具有组织特异性表达图式的转基因斑马鱼，以及斑马鱼早期胚胎发育相关基因，以建立相应的转基因鱼系与斑马鱼基因表达模式信息库。迄今已获得1, 670种报告基因带有特异表达模式的子代鱼系（F1），其中包括30种在胰腺中特异表达报告基因和40多种在血液和/或心血管系统特异表达报告基因的鱼系；鉴定了其中的118个Tol2插入位点，附近的基因大部分为尚未见报道的新基因。这部分工作由我室与美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）林硕教授的实验室共同合作进行。

（2）突变体的筛选：在与美国国立卫生研究院（NIH）下属的国立人类基因组研究所（NHGRI）Shawn Burgess教授进行科研合作的基础上，在国内建立了斑马鱼基因插入诱变技术平台；应用反转录病毒插入诱变技术对斑马鱼进行大规模基因饱和突变筛选，以建立斑马鱼全基因组随机突变文库与突变体信息库。这部分工作采用了高通量的LM-PCR技术，辅以大规模测序与精子冻存保种的全新策略。目前已筛选到了1000个基因内的插入，其中大部分为功能未知的新基因。

最近，本实验室建立了一种构建TALE核酸酶（TAELN）的新方法，称为“Unit Assembly”，并应用TALENs在斑马鱼中成功地实现了可稳定遗传的基因组定点突变，同时，跟长双链DNA相结合，还实现了通过同源重组精确改造斑马鱼基因组。目前，我们已经成功地突变了100多个斑马鱼内源基因，突变成功率约为74％，其中大部分基因的突变效率大于30％。

胰腺是一个既包含内分泌腺又包含外分泌腺的特殊的复合器官，它的形态发生既涉及到多种信号通路参与的复杂的细胞分化过程，又存在细胞大量扩增的发育阶段，是研究体内细胞增殖与分化的良好模式。同时，糖尿病、胰腺癌等严重危害人类健康的疾病与胰腺的发育缺陷与功能失调密切相关，因而胰腺发育机制的研究具有不言而喻的理论与应用价值。然而，胰腺作为一个内脏器官，由于其深陷在身体内部而难以进行深入研究，因此胰腺的发育机制研究相对其它器官而言比较滞后。在上述通过Tol2增强子诱捕筛选得到的胰腺被特异标记的鱼系中，GFP报告基因的可视标记无疑为我们研究胰腺提供了一个极好的条件。我们将充分发挥上述转基因鱼系与突变体的优势，以胰腺的发育为模式，研究细胞增殖与分化在胰腺形成中的作用及其机制。

人类对脊椎动物造血系统以及心血管系统的研究已有几百年的历史，但是它们的发育机制尚未完全阐明。脊椎动物进化过程中造血过程与心血管的发生是高度保守的，并且造血系统和血管系统共同起源于腹侧中胚层（ventral mesoderm），两者可能具有共同的前体细胞—成血成血管干细胞（hemangioblast），经进一步诱导分化形成成血细胞（hematopoietic stem cell）及成血管细胞（angioblast）。丰富的细胞类型与逐级的分化过程使造血系统成为研究体内细胞增殖与分化调控机制的理想体系。斑马鱼胚胎在受精后24小时即可开始心脏跳动与血液循环，并且胚胎通体透明，血红素呈红色，在体视镜下极易观察；更为宝贵的是，循环系统有缺陷的斑马鱼胚胎依然能够依靠体表的气体交换存活几天，这样就为我们研究发生缺陷的原因争取了时间。无疑，斑马鱼是开展血液与心血管发育机制研究的理想材料。我们将从上述Tol2增强子诱捕与反转录病毒插入诱变的筛选结果中，选择血液和/或心血管系统特异的基因与突变体，深入研究细胞增殖与分化在脊椎动物血液与心血管系统发育过程中的作用及其调控机制。