北大近年来首篇Nature Methods文章

Nature Methods杂志是Nature出版社旗下的著名期刊之一，也是方法学领域的权威刊物，在去年之前，大陆学者在此刊物上发表的技术文章仅有3篇。近期来自北京大学生科院，加州大学洛杉矶分校的研究人员在这一著名期刊上获得了备受关注的技术：TALEN的新进展，这也是近年来北京大学的首篇Nature Methods文章。

　　

生物通报道：Nature Methods杂志是Nature出版社旗下的著名期刊之一，也是方法学领域的权威刊物，主要刊载具有创新性的技术进展，在去年之前，大陆学者在此刊物上发表的技术文章仅有3篇。近期来自北京大学生科院，加州大学洛杉矶分校的研究人员在这一著名期刊上发表了题为“TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish”的文章，获得了备受关注的技术：TALEN的新进展，这也是近年来北京大学的首篇Nature Methods文章。

文章的通讯作者是北京大学生科院张博（Bo Zhang）教授，以及加州大学洛杉矶分校的林硕(Shuo Lin)教授，其中张博教授获得过不少斑马鱼研究方面的重要成果，曾成功突变了7个斑马鱼内源基因，其中大部分基因的突变效率大于30%，有3个基因的突变效率更是接近100%，并且近年以通讯作者也在Nat. Biotechnol，PNAS等高水平杂志发表论文多篇，获国家自然科学奖二等奖与中国高校科学技术奖一等奖。

斑马鱼（Danio rerio）是进行发育生物学研究的理想模式脊椎动物。不少重要的科学发现就来自于这种小动物，张博教授研究组主要以其功能基因组研究手段为切入点，进行基因功能以及表达调控机制的研究。此次这项研究则主要聚焦于目前一种备受关注的技术在斑马鱼同源重组中的精确基因组修改。

这种技术就是TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) ，这是一种人工改造的限制性内切酶，是将TALE的DNA结合域与限制性内切酶 (FokⅠ) 的DNA切割域融合而得到。由于TALE的DNA结合域中的重复氨基酸序列模块可以与单碱基发生特异性结合，因此理论上可以任意选择靶DNA序列进行改造，是一种非常有效的基因组改造工具酶。

由于TALEN在细胞中与基因组的靶位点结合，形成二聚体发挥内切酶活性，导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA断裂（DSB，Double-Strand Breaks），从而诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过非同源性末端接合机制（NHEJ, Non-homologous End Joining）修复DNA。NHEJ修复机制并不精确，极易发生错误（缺失/插入），从而造成移码突变，因此可以达到基因敲除的目的。

2012年Science十大科学突破中提到了这种技术，指出这种方法相比ZFNs和 morpholinos具有几个优势：它们更便宜、更有效，尤其是以一种开发活性形式应用时。ZFNs只能靶向特异序列，而TALENs有潜力对任何的DNA序列起作用。Morpholinos的效应是短暂的，而TALENs可造成永久性的改变。

以斑马鱼为研究对象，在最新这项研究中，研究人员提出TALENs在斑马鱼同源重组的靶向基因敲除能实现精密基因组改造。他们将TALEN的mRNAs，以及一种带有长同源臂（靶向酪氨酸羟化酶）的供体载体共同注射到斑马鱼卵细胞中，结果发现这种有效的基因修改能通过生殖系传递。此外研究人员还通过靶向另外两种基因，证实了这一点。

这不仅提出了一种基因工程的新方法，而且带有dsDNA供体的斑马鱼同源重组，也拓展了这种模式动物的应用前景。

（生物通：张迪）

原文摘要：

TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish

We report gene targeting via homologous recombination in zebrafish. We co-injected fertilized eggs with transcription activator–like effector nuclease mRNAs and a donor vector with long homologous arms targeting the tyrosine hydroxylase (th) locus, and we observed effective gene modification that was transmitted through the germ line. We also successfully targeted two additional genes. Homologous recombination in zebrafish with a dsDNA donor expands the utility of this model organism.

作者简介：

张博 博士

北京大学生命科学学院教授
Bo Zhang, Ph.D.
Professor
Center of Developmental Biology and Genetics
College of Life Sciences
Peking University
Beijing 100871
P. R. CHINA

研究概述：

本实验室主要兴趣在于：

1 以斑马鱼为模式研究脊椎动物早期胚胎发育基因表达调控与器官形成机制，特别是血液与心血管系统以及胰腺等内脏器官的细胞分化与发育。
2 斑马鱼功能基因组研究。

斑马鱼（Danio rerio）是进行发育生物学研究的理想模式脊椎动物。本实验室以功能基因组研究手段为切入点，通过筛选斑马鱼中与血液、心血管或胰腺发育相关的突变体与基因，鉴定基因的表达图谱，并进行基因功能以及表达调控机制的研究。
（1）新基因的筛选：应用以Tol2转座子为基础的“增强子诱捕”（enhancer-trap）技术、以绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP）为报告基因大规模筛选具有组织特异性表达图式的转基因斑马鱼，以及斑马鱼早期胚胎发育相关基因，以建立相应的转基因鱼系与斑马鱼基因表达模式信息库。迄今已获得1, 670种报告基因带有特异表达模式的子代鱼系（F1），其中包括30种在胰腺中特异表达报告基因和40 多种在血液和/或心血管系统特异表达报告基因的鱼系；鉴定了其中的118个Tol2插入位点，附近的基因大部分为尚未见报道的新基因。这部分工作由我室与美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）林硕教授的实验室共同合作进行。
（2）突变体的筛选：在与美国国立卫生研究院（NIH）下属的国立人类基因组研究所（NHGRI）Shawn Burgess教授进行科研合作的基础上，在国内建立了斑马鱼基因插入诱变技术平台；应用反转录病毒插入诱变技术对斑马鱼进行大规模基因饱和突变筛选，以建立斑马鱼全基因组随机突变文库与突变体信息库。这部分工作采用了高通量的LM-PCR技术，辅以大规模测序与精子冻存保种的全新策略。目前已筛选到了244个基因内的插入，其中大部分为功能未知的新基因。
胰腺是一个既包含内分泌腺又包含外分泌腺的特殊的复合器官，它的形态发生既涉及到多种信号通路参与的复杂的细胞分化过程，又存在细胞大量扩增的发育阶段，是研究体内细胞增殖与分化的良好模式。同时，糖尿病、胰腺癌等严重危害人类健康的疾病与胰腺的发育缺陷与功能失调密切相关，因而胰腺发育机制的研究具有不言而喻的理论与应用价值。然而，胰腺作为一个内脏器官，由于其深陷在身体内部而难以进行深入研究，因此胰腺的发育机制研究相对其它器官而言比较滞后。在上述通过Tol2增强子诱捕筛选得到的胰腺被特异标记的鱼系中，GFP报告基因的可视标记无疑为我们研究胰腺提供了一个极好的条件。我们将充分发挥上述转基因鱼系与突变体的优势，以胰腺的发育为模式，研究细胞增殖与分化在胰腺形成中的作用及其机制。
人类对脊椎动物造血系统以及心血管系统的研究已有几百年的历史，但是它们的发育机制尚未完全阐明。脊椎动物进化过程中造血过程与心血管的发生是高度保守的，并且造血系统和血管系统共同起源于腹侧中胚层（ventral mesoderm），两者可能具有共同的前体细胞—成血成血管干细胞（hemangioblast），经进一步诱导分化形成成血细胞（hematopoietic stem cell）及成血管细胞（angioblast）。丰富的细胞类型与逐级的分化过程使造血系统成为研究体内细胞增殖与分化调控机制的理想体系。斑马鱼胚胎在受精后24小时即可开始心脏跳动与血液循环，并且胚胎通体透明，血红素呈红色，在体视镜下极易观察；更为宝贵的是，循环系统有缺陷的斑马鱼胚胎依然能够依靠体表的气体交换存活几天，这样就为我们研究发生缺陷的原因争取了时间。无疑，斑马鱼是开展血液与心血管发育机制研究的理想材料。我们将从上述Tol2增强子诱捕与反转录病毒插入诱变的筛选结果中，选择血液和/或心血管系统特异的基因与突变体，深入研究细胞增殖与分化在脊椎动物血液与心血管系统发育过程中的作用及其调控机制。