PNAS：“通用”流感疫苗研发的第一步

在最近的PNAS杂志上发表的一项研究中，美国斯坦福大学的研究人员，利用无细胞蛋白合成过程和一种简单的重折叠方案，快速地产生了正确折叠的H1N1病毒HA蛋白颈部结构域，迈出了通用流感疫苗研发的第一步。

　　

生物通报道：每年接近流感季节，都会引发一个生或死的医疗猜谜游戏。有许多不同的流感菌株，年复一年它们都会发生变化。所以，在每个季节，当局必须做出一个有根据的推测，告诉制造商他们应该生产抗击哪种流感变体的疫苗。

根据美国疾病控制和预防中心调查显示，即使当上述系统工作时，流感相关的疾病，仍然引起每年3000到49,000美国人死亡。一次坏的猜测或者一种有毒菌株的意外出现，都可能使这个死亡人数上升。

在这种背景下，斯坦福大学的研究人员，报道了他们迈向生产通用流感疫苗的第一步，其设计的这种通用流感疫苗，与今天可用的病毒特异性接种菌相比，能够为我们提供更快速和更广泛的保护。

由斯坦福大学工程学院的化学和生物工程师James R. Swartz教授带领的研究团队，在最近的PNAS杂志上详述了他们的研究成果。

他们的方法，使我们更好地理解流感病毒表面一个关键蛋白的结构，并提出了基于这个结构来生产疫苗的新方法。

流感病毒是由不同的蛋白组成。从病毒表面突出的是一种称为血球凝集素（HA）的蛋白的数以百计的拷贝。HA的每个拷贝就像一个蘑菇，具有头部和颈部。HA的头部可有助于确定一个给定流感病毒株的毒力。

现在使用的疫苗，都是以含有HA蛋白头部的灭活的病毒为基础。当流感疫苗被注射入我们血流中时，我们的免疫系统就会把HA头部视为一个目标，并产生抗体来抗击它们。

接种疫苗的实质，是要教会免疫系统去识别目标。如果我们在获得接种疫苗后，暴露流感病毒，我们的免疫系统就会准备，在入侵病毒复制足够的拷贝使我们生病之前，识别和根除它们。

鉴于流感病毒的头部每年都会不同，而蛋白的颈部随时间则更加恒定，Swartz和他的同事们将他们的新疫苗方法，建立在这个理解的基础之上。

从理论上讲，基于HA蛋白颈部的疫苗，应该会更广泛地预防不同的流感病毒株，可能提供普遍的保护。此外，由于颈部每年都保持相对稳定，一旦我们的免疫系统产生那个抗原的抗体，很有可能就是多季节的保护。

但是，这种方法仍然是实验性的，尚未在患者中进行检测。

斯坦福研究人员的这篇论文重点在于开发这种通用疫苗的第一步：制造一种能够注射入血流的蛋白颈部片段，简言之，就是制造一个目标或抗原，吸引我们免疫系统的注意力，触发一个有效的防御。

Swartz实验室的博士后Yuan Lu，也是研究团队成员，作为第一作者，在PNAS上概述了这项研究工作的详细过程。

研究人员，开始于一段含有H1N1病毒蛋白结构制造指令的DNA序列。他们从编码整个HA蛋白（头部和颈部）的DNA序列入手。然后，去掉头部的DNA编码。因此，他们编辑的DNA链只含有蛋白颈部的制造指令。

斯坦福研究团队利用一种相对较新和实验性的过程来制造病毒蛋白的颈部。这个过程被称为无细胞蛋白合成（CFPS）。为了了解CFPS如何工作，让我们回顾一下蛋白在自然中是如何制造的。

在所有细胞内，都有称为RNA聚合酶和核糖体的分子机器。这些RNA聚合酶和核糖体能够“读取”DNA，根据遗传密码中的指令，制造蛋白。在无细胞的蛋白合成中，科学家们打开细菌细胞，制造一种含有许多这类核糖体的分子液体。科学家们知道如何将他们的DNA指令直接发送到这些蛋白工厂中。

CFPS的优势在于，它可以在几小时或几周甚至几个月内产生蛋白，而采用被批准用于现在医学用途的做法来制造流感疫苗的蛋白，则需要很长的时间。斯坦福的研究人员利用这个CFPS过程，来创建和修改病毒蛋白的颈部，对于实验性疫苗抗原将非常有用。

为此，他们必须解决两个基本问题。首先，CFPS过程产生一个单链蛋白，或单体。但是HA颈部是一个三聚体，或三个完全相同的单体编织在一起。第二，他们的基因工程抗原最初是不溶的。换句话说，它不能被制造成液体疫苗形式。

记住，一切都开始于一段DNA序列。让参与的抗原将一段DNA序列，送入包含RNA聚合酶和核糖体的分子液体中，提取病毒蛋白颈部，然后确定它们是否已经产生了起码具有注射抗原潜力的可溶三聚体。

研究人员经过几十次实验，产生了能够折叠成可溶三聚物的单体。我们知道，蛋白质由氨基酸构成。因此，改变蛋白颈部的结构，就包括编辑DNA来改变特定氨基酸，使这些新指令再次运行在核糖体工厂，提取成品和测试结果。

研究人员经历了几十次尝试，历时两年的时间，但是他们最终，将一个DNA小片段注入CFPS过程，产生了一种可溶的病毒蛋白颈部结构域，这可能是一种很好的抗原。这就是他们在PNAS论文中所报道的。Swartz说：“这是一个艰难的过程。许多实验室一直都在试图开发一种HA颈部结构域疫苗，我们很高兴为此做出了贡献。”

在知道这种病毒颈部方法是否能够生产一种更好的流感疫苗之前，研究人员还需要完成很多工作。接下来，Swartz和他的团队想要把他们的颈部蛋白吸附到一种病毒样颗粒上。这个想法，将会产生一种更大、更好的目标，利用这个目标能引起免疫系统的反应。如果这被证明是成功的，那么新的候选疫苗将必须接受在动物中进行的安全性和有效性实验，最终用于大规模的人体临床试验。

最近估计，流感有关的疾病引起的死亡人数，每年在250,000到500,000之间。“这对世界健康来说是一项非常重要的项目，”Swartz说，并指出，疫苗必须要广泛有效地抗击不同的流感病毒株，而且其生产成本也要便宜，以便使其能够被广泛使用。“这些都是巨大的挑战，但是我们将致力于努力克服这些挑战。”（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Production and stabilization of the trimeric influenza hemagglutinin stem domain for potentially broadly protective influenza vaccines
Abstract：The rapid dissemination of the 2009 pandemic H1N1 influenza virus emphasizes the need for universal influenza vaccines that would broadly protect against multiple mutated strains. Recent efforts have focused on the highly conserved hemagglutinin (HA) stem domain, which must undergo a significant conformational change for effective viral infection. Although the production of isolated domains of multimeric ectodomain proteins has proven difficult, we report a method to rapidly produce the properly folded HA stem domain protein from influenza virus A/California/05/2009 (H1N1) by using Escherichia coli-based cell-free protein synthesis and a simple refolding protocol. The T4 bacteriophage fibritin foldon placed at the C terminus of the HA stem domain induces trimer formation. Placing emphasis on newly exposed protein surfaces, several hydrophobic residues were mutated, two polypeptide segments were deleted, and the number of disulfide bonds in each monomer was reduced from four to two. High pH and Brij 35 detergent emerged as the most beneficial factors for improving the refolding yield. To stabilize the trimer of the HA stem-foldon fusion, new intermolecular disulfide bonds were finally introduced between foldon monomers and between stem domain monomers. The correct immunogenic conformation of the stabilized HA stem domain trimer was confirmed by using antibodies CR6261, C179, and FI6 that block influenza infection by binding to the HA stem domain trimer. These results suggest great promise for a broadly protective vaccine and also demonstrate a unique approach for producing individual domains of complex multimeric proteins.