创新参选：化学交联肽段质谱鉴定技术的开发与应用

　　

“赛默飞之生物通2012实验室创新技术大奖”评选活动开展以来，生物通已经陆陆续续收到不少项目，这些项目中有的能减少实验步骤，有的能降低实验成本，还有一些改进了实验设备，让我们的实验过程更加轻松。
生物通将会陆续公布一些项目，以便大家分享这些创新技术。同时为了感谢这些分享实验技巧的参选者，生物通也准备了一些精美礼品寄出，同时近期我们还将进行第二轮抽奖，以飨读者。

 

参选项目：化学交联肽段质谱鉴定技术的开发与应用

背景：基于生物质谱的化学交联多肽鉴定技术（CXMS）对于蛋白质折叠以及蛋白质-蛋白质相互作用研究能够提供丰富的实验信息。它能够帮助确定大型蛋白质复合物的整体结构，提供复合物内各亚基之间的直接相互作用关系以及各亚基之间的相互作用界面。CXMS对于蛋白质样品的纯度要求低，远比X-射线晶体衍射技术对蛋白质纯度的要求要低。CXMS潜在的能够成为一种通用的实验技术，在每一个生物实验室中普及。

CXMS技术至今没有被广泛的应用，主要因为该技术在应用过程中存在一些技术瓶颈。首先，酶切后的化学交联样品高度复杂。它不仅包含普通多肽，还包括mono-linked，loop-linked和inter-linked多肽。其次，对于蛋白质折叠和蛋白质-蛋白质相互作用研究最为重要的inter-linked多肽，由于其丰度低，常常难以被鉴定。更进一步，inter-linked多肽的谱图十分复杂，它不仅包含两条多肽的碎片离子，还包含断裂两次的内部离子，以及跨两条肽序列并包含交联剂的碎片离子。同时，交联剂本身也会发生断裂，形成全新的碎片离子。

传统的数据库搜索引擎如MASCOT, SEQUEST等，无法分析这样的谱图。虽然近年来有一些针对化学交联肽段谱图的全新数据库搜索引擎出现，但是这些软件并没有充分利用谱图中的碎片离子。另外一些实验策略虽然可以继续使用传统的数据库搜索引擎，但是它们往往依赖于特殊的化学交联剂如PIRs， CBDPs，DSSO等，而这些化学交联剂的使用效率并没有经过广泛的验证。化学交联多肽的数据质量评价与控制是另外一个巨大的挑战。因为化学交联多肽通常包含两条肽序列，候选搜索空间十分巨大。最后，化学交联多肽谱图标注也十分重要，目前相应的标注软件十分稀少。

方法改进：我们发展了一套完整的化学交联肽段鉴定策略。优化了化学交联肽段鉴定的各个环节：交联样品的前处理，液相色谱分离，质谱鉴定，并且与中科院计算所合作开发了化学交联多肽鉴定软件pLink。pLink可以处理全蛋白质组化学交联的样品，能够有效估算数据的假阳性率，并且能够对谱图进行自动标注。

pLabel能够对交联肽段谱图进行更加详尽的标注。我们将CXMS技术应用到简单蛋白质样品，复杂蛋白质复合物样品，蛋白质免疫共沉淀实验，以及大肠杆菌和秀丽线虫全蛋白质组化学交联实验，取得了良好的鉴定结果，充分证明了该方法的有效性。

结果：在大肠杆菌全蛋白质组交联样品中，我们一共鉴定到394对inter-linked交联多肽，在同样的样品上，我们的鉴定数目5倍于之前发表的最好的鉴定结果。将化学交联技术与常规的蛋白质免疫共沉淀实验相结合，我们成功鉴定到了化学交联多肽，能够有效的区分直接与间接的蛋白质相互作用，并且能够鉴定蛋白质相互作用的界面。

 

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