-
生物通官微
陪你抓住生命科技
跳动的脉搏
PacBio RS第三代单分子测序系统全球访谈纪要（三）[心得点评]
主题三：PacBio RS系统首次实现对碱基修饰进行直接测序
【字体： 大 中 小 】 时间：2013年01月14日 来源：生物通
编辑推荐：
生物通就几个广受关注的主题征询收集了众多声名赫赫的PacBio用户的心得意见，以用户现身说法的方式，“原汁原味”为您呈上这一第三代单分子测序系统全球访谈纪要系列报道。实现对碱基修饰进行直接测序的意义所在？本文介绍了碱基修饰直接测序法的经典案例，以及一些先行者的看法，包括NEB公司CSO Richard Roberts。
主题三：实现对碱基修饰进行直接测序的意义所在？
Matthew Waldor：
我们比较好奇到底是什么赋予E. coli O104:H4这么与众不同的高致病性，直到我们发现这个菌株有很多基因的甲基化形式与其他菌株不同。我们最初发现该菌株中有个噬菌体插入片段，上面有编码甲基化相关的基因序列。“我们对此有些疑惑，这个噬菌体引入的甲基化系统是否会影响菌株的甲基化谱，从而进一步影响菌株的致病性。”
甲基化在细菌基因表达和致病性影响中发挥的作用业界已有很多共识，但我们一直对其基因组的全甲基化谱知之甚少。PacBio的单分子实时测序功能很对我们的胃口。“利用PacBio技术，你可以通过监测DNA合成得到碱基序列信息，同时，你还额外得到了每个碱基如何掺入的动力学信息。”我们用PacBio对E.coli O104:H4菌株进行了“前所未有的全基因组甲基化谱分析”，共发现了50,000多个甲基化位点。不仅是甲基化位点，我们还发现了11个直接参加菌株甲基化修饰的酶，其中有7个甲基化转移酶之前从未研究过。更令人震惊的是，噬菌体引入的甲基化系统使该菌株1/3以上的基因表达水平发生了改变。“这真是一个爆炸性的发现，没想到基因组上一个小小病毒的插入片段会引起转录水平上如此波澜壮阔的全局效应。”这些转录水平变化显著提高了菌株的生长繁殖和运动能力，从而侧面促进了致病性。感谢PacBio单分子实时测序技术最终为我们答疑解惑。“这就相当于拥有了一个全新的显微系统，能把之前无法看到的变得一览无余。它必将在微生物领域催生出更多更新的DNA修饰研究方向，在我们能想到的不久的将来，还会广泛应用到其他物种领域中去。”
注: 详情请见参考文献2/3、参考影像4、生物通往期文章1/2/5。
Eric Schadt：
DNA序列本身不足以说明疫情爆发菌株异乎寻常的高致病性。“相同的血清型，为什么疫情爆发菌株的致病性就这么强？要想彻底解决这个问题，如果你不能全局性地分析任何确定已经发生的变异，那么你只会离答案渐行渐远。”于是我们想对碱基修饰进行一轮全基因组范围的扫描，尤其是甲基化修饰。因为近十年来已有大量报道，认为甲基化在微生物致病过程中所发挥的功能举足轻重。
其他任何的测序仪完全不可能直接分析这些表观遗传学标记，因为它们在测序前需要PCR扩增，一扩增这些修饰标记就被置换而消失殆尽了。但PacBio的单分子实时测序（SMRT）法可以办到，利用DNA聚合酶的动力学特征，碱基掺入时产生的停顿间隔脉冲信号足够敏感，足够区分12种以上不同类型的碱基修饰。碱基修饰谱分析是PacBio测序数据中的固有部分，你所需要的只是把之前的测序数据重新调出来，再找些种合适的软件分析即可。“通过这种方式我们发现了一些跟菌株致病性相关的碱基修饰，这是全新的发现，因为之前人们根本无法想象也从没见过。”
在一天之内实现de novo测序同时进行全基因组甲基化谱分析是微生物研究领域向精细功能分析迈进的重大变革。“把测序获得的A、G、C、T信息整合成完整基因组图谱是一个工程浩大的拼图游戏，长读长在其中无疑体现了无可替代的重要性。但千万别忘了，序列上的碱基还可以被化学修饰，通过碱基修饰可以操纵特定蛋白和特定序列的结合，从而实现重大的功能改变。如果光有序列信息，而没有碱基修饰信息，你就是无法看到变异或表型多样性的全部及渊源。如果当时我们没有查看碱基修饰，我们就错过了深入了解致病菌进化历程和完整绘制其基因组图谱的机会。”
“生物网络的复杂性体现在遗传信息不仅仅体现在DNA序列组成上，表观遗传学可以说是当今疾病研究中最激动人心、发展最为蓬勃的领域。PacBio的全基因组甲基化谱分析能力和高度重复区域直接测序能力将极大推动表观遗传学在人类健康事业中的研究进程，同时还可以有效缩减项目花销。”
注: 详情请见参考文献2/3、参考影像4、生物通往期文章1/2/5。
Stephen Turner：
“现行的方法，表观遗传学和基因组学研究是截然分开的。没人会通过研究亚硫酸氢盐处理过的样品（表观遗传学方法）而声称从中得出了基因组学研究的重大进展，事实上我们在这个传统方法中已经丢失了胞嘧啶所应该包含的其他信息。”有别于二代测序，PacBio RS系统实时观察DNA的合成过程并记录荧光标记的碱基掺入信息，它不需要扩增，而不扩增恰恰可以保留表观遗传信息。PacBio的独特之处还在于，它不需要进行亚硫酸氢盐转化等额外实验步骤，聚合酶动力学的测定不会对DNA一级序列产生任何不良影响，最后你甚至可以放弃HPLC、质谱，因为它们实在太慢了。PacBio RS系统可以在测序的同时检测表观遗传学修饰，从而把表观遗传学和基因组学研究有机整合在一起。
事实上，在开发PacBio单分子实时测序技术的最早期，我们就考虑过把PacBio逐渐引向解读DNA修饰的方向。当碱基有额外修饰时，DNA聚合酶的合成速度会减慢，对应的信号会被检测出来。“这就好比是开车经过减速带，一个凸起的路障会干扰车速。每种碱基修饰事件都会使聚合酶的‘停顿模式’产生微小差异，最终反映到荧光脉冲信号的间隔上。” 毕竟PacBio的光学系统是顶尖的，只要我们捕捉得到，我们就有分析并把它们区分开的可能，实时检测的特点将赋予研究人员解读任何一种碱基修饰的可能性。
PacBio给出的还不仅仅是碱基修饰的一维信号，由于DNA聚合酶会接触11个碱基，所以相当于这11个位置的碱基掺入速度和节律都会被记录下来。或者说，碱基修饰对聚合酶动力学的影响并不仅仅停留在自身，脉冲信号之间的间隔往往还与修饰碱基的上下游相关，这里面似乎还有其他暗示。“如果没有SMRT技术，这些现象就会一直被忽略了。”
我们一般推荐采用25-250X的测序深度检测甲基化修饰，在目前容忍5%假阳性率的情况下，准确率可以达到90%以上。我们还会继续优化，在不影响准确率的基础上将所需的测序深度降下来（比如使用富集法可以使覆盖度降至5X）。
除了甲基化，我们还尝试直接检测其他DNA修饰，比如在一些DNA损伤的场合。我们现在可以直接在DNA单分子上检测5-hC、5-hmU、5-hU、1-mA、6-mA、8-oxoA、BPDE、6-mT、6-mG等碱基修饰。对于一些非常新颖的碱基修饰检测，我们目前还需要通过人工根据经验和设置对照进行比对和判定，不久的将来，我们会优化出算法，用软件直接读出来。
注: 详情请见参考文献1/2、参考影像1/2、生物通往期文章1/2/3/4。
Richard Roberts：
翻译后修饰研究持续升温，尤其是甲基化研究。在哺乳动物中，研究热点从5-mC一直延续到5-hmC、5-fC和5-caC。甲基化在细菌基因组中也很常见，它们作为限制修饰系统的一部分，保护宿主不受其他限制性内切酶的伤害。“我们对在细菌基因组中发现新颖甲基化的工作非常感兴趣。甲基化修饰现在认为非常普遍，但之前因缺乏定位这些甲基化的简单方法，它们常常就被忽略了，直到PacBio单分子测序技术的出现。”
我们公司正在研究一类比较特别的限制性内切酶，这类酶的识别序列包含甲基化信息，但又不能通过传统的方法发现识别序列，因为识别基本上是随机的。“这个操作起来很难，往往需要几个月才能找出清晰的识别序列，不光费时而且费力，我们非常不情愿这样做。”所以唯一解决的办法是直接测序分析甲基化位点。“通过与PacBio合作完成的全基因组甲基化谱分析，我们可以找到甲基化酶的识别序列，无论是什么甲基化酶，只要它在那。”
我们用PacBio RS系统对6种细菌基因组进行了重测序，不仅鉴定出细菌基因组中新的胞嘧啶和腺嘌呤甲基化位点，还鉴定出介导这些表观遗传学标志的甲基转移酶。“这真是我们首次有能力对细菌基因组进行全方位的甲基化组学分析，也只有PacBio RS系统才能让我们这样干！”也许你可能认为通过计算法进行甲基转移酶位点预测的方法也行得通，但并不是所有甲基转移酶都可以这样做，如果有一类甲基转移酶稍有变构，其识别Motif就会发生改变。
目前我们的合作主要在6-mA和4-mC修饰，我们还在开发5-mC修饰评估的方法学，这个信号相对比之前两个要弱，我们已经有所进展，并准备买一台PacBio今后独立开发后续的其他修饰评估法。
注: 详情请见参考文献6、生物通往期文章3/6/8。
Jonas Korlach：
“NEB跟我们说，想要做一件创造历史的事情，即对细菌的基因组进行完整的甲基化修饰谱分析，因为之前没有哪家这样干过。这个想法很吸引人，于是我们一拍即合。”
我们的研究人员对NEB提供的6种细菌基因组进行了重测序。这些细菌之前也在其他平台上测序过，但这次是利用PacBio RS系统专门来解读甲基化信号。他们之前将某个甲基化转移酶基因克隆到质粒上，并在甲基化缺陷型大肠杆菌菌株中增殖，配合他们的计算预测方法来寻找并分析其识别位点。然而，这套方法没有达到理想效果。“因此，我们决定用PacBio单分子测序方法直接分析细菌的甲基化组学，以便获得甲基化程度的准确评估。”通过单分子测序，我们在细菌基因组中发现了多个新的6-mA和4-mC修饰，并指定了负责那些甲基化模式的甲基转移酶。
注: 详情请见参考文献6、生物通往期文章3/6/8。
Donncha Dunican：
5-mC和5-hmC的结构非常类似，用传统的发现5-mC的方法（如限制性内切酶法和亚硫酸氢盐测序法）不能很好的区分出5-hmC。“我们对5-hmC修饰非常好奇，这个修饰研究以后必定会大热，但前提是必须找到一个合适的方法有效地鉴定出来。NIH等机构花巨资以期在大量不同的人类样本中用表观基因组测序法发现并区分5-mC和5-hmC，但后来发现传统的测序法根本就是徒劳。”其结果是，早期发现的那些甲基化谱数据必须要经过新一轮的重新分析，以便从中挖掘出被淹没的5-hmC。“揭示5-hmC的存在和功能是表观遗传学研究领域的一个严峻挑战，我们为此不得不开发出一个更为行之有效的测序化学配方。”
Suneet Agarwal：
我们开发了两种方法来捕获富集羟甲基化修饰。一种方法是用亚硫酸氢盐法将hmC转变为CMS，再用CMS抗体把hmC分子捕获下来。另一种方法是先用噬菌体酶在hmC上加上葡萄糖，然后通过化学反应把糖分子转变为功能醛基，再通过醛基在hmC上连接生物素，从而最终可以通过生物素-链霉亲和素反应把hmC分子捕获下来（第二种方法与Chuan He开发的方法非常类似。）“但这些方法只是说明了有5-hmC，但并没有说明在哪。所以我们迫切希望能把这些方法和其他技术结合起来，那个技术需要能提供实时单分子测序的能力。”
Jonas Korlach：
“这些定向富集的策略也可以与二代测序法通用，但是，如果你不能拿到单碱基分子水平的分辨率，你就无法得到真正的测序结果和修饰信息。”
Chuan He：
很多研究人员还在用亚硫酸氢盐测序法研究甲基化修饰，但这种方法无法区分出羟甲基化修饰。“但在PacBio系统上，羟甲基化测序和甲基化测序可以统一起来，运行一次就可以同时分析两种修饰。”
尽管利用第三代单分子测序法可以区分5-mC和5-hmC，但需要大约250X的覆盖度才能检测到5-hmC。“我们就是想把5-hmC的检测变得敏感些，最容易想到的是，加个标签以便富集信号。”我们对5-hmC进行了选择性化学标记，在引入叠氮修饰的基础上反应安装上一个生物素标签。通过这种方法就可以富集基因组中的5-hmC，减少所需的测序量。我们把5-hmC的化学标记富集法和PacBio的单分子测序技术结合起来，可以实现在单碱基水平检测疾病发生发展相关的表观遗传标志。化学修饰富集法使DNA聚合酶在碱基修饰处的停顿延长，使检测成为可能。“停顿时间与不处理状态时比较延长了10-20倍，这样你就可以信心满满地下结论，这儿确实存在5-hmC修饰。”
这套方法分别在已知的合成DNA片段和小鼠胚胎干细胞样品中得到了验证。在检测小鼠胚胎干细胞中的碱基修饰时，我们还能清楚地区分5-hmC发生在DNA哪条链上。这种修饰在小鼠发育中作用明显，在小鼠成体中修饰程度提高了4-5倍，在其他诸如与神经退行性疾病、低氧、血管生成等相关的基因上也发现了5-hmC修饰。“我们目前并不知道5-hmC修饰在这些疾病相关基因上的具体功能，但可以肯定这里面有联系。”
我们把化学标记富集法的使用许可权交给了Active Motif公司，他们开发出了试剂盒（Hydroxymethyl Collector Kit）。通过这个试剂盒，不光可以检测出羟甲基化修饰，还可以显著降低检测覆盖度。比如PacBio推荐5-hmC检测需要250X 覆盖度，但使用试剂盒后覆盖度可以降低至只要5X 覆盖度。我们还在结合PacBio平台开发其他甲基化修饰的化学标记富集法，主要还是想把检测覆盖度不断降下来。
注: 详情请见参考文献5、生物通往期文章3/7。
Stephen Turner：
定向富集法可以放大5-hmC碱基修饰的检测信号，经过富集后，修饰碱基变得更大，但却不影响DNA聚合酶对它的掺入合成，最终在较低覆盖度下就能真实解析5-hmC修饰。“修饰碱基产生的动力学信号很强，仅需一个分子就足以检测它的碱基修饰类型。这个结果是空前的。”
“5-hmC的发现不是终点，而只是个起点。仅由四个碱基组成DNA的说法也将不复存在。”
Kevin Corcoran：
“我们很高兴为测序界提供第一款也是目前唯一一款碱基修饰直接检测工具，让研究人员能够把检测碱基修饰作为测序流程中不可缺少的一部分。这是PacBio的一个里程碑，也是科学界一个宝贵的新工具。”
Edwin Hauw：
我们此次推出的新软件能够让科研人员轻松检测并查看这些DNA修饰。软件通过测定DNA碱基掺入的速率而发挥作用，该信息在测序过程中自动收集。“这是PacBio单分子实时测序的一个独到之处。”
PacBio的用户现在可以使用这套软件在微生物和致病菌中研究甲基化及其它表观遗传学事件，我们在网站上还有研究细菌甲基化组的指引。目前软件可以自动识别5-mC、4-mC、6-mA、6-hmA等碱基修饰，其它碱基修饰可参照相关文献通过设立对照进行检测。我们还将对软件不断进行升级，2013年陆续推出其他各种碱基修饰类型。
Jonas Korlach：
最近PacBio为微生物甲基化谱分析提供了一个碱基修饰鉴定工具包，除此之外，PacBio还为准确鉴定修饰类型给出了建设性意见，比如提供碱基特定修饰对应的二级峰型图。PacBio长读长的特点“最终将允许表观遗传分型”，会帮助研究人员更好地理解诸如染色体失活和遗传印记等表观现象，同时可以针对相应疾病的发生发展进行更精细的表观遗传谱图分析。
Robert Mandrell：
“甲基化谱分析可以让我们有效区分不同菌株对人类宿主的致病性影响。”通过与PacBio合作，我们对导致2007年比利时冰淇淋大肠杆菌疫情和2010年美国亚利桑那生菜大肠杆菌疫情的爆发株进行了研究，目的是揭示了致病菌的基因组多样性和毒力演化。最初我们只是想借助PacBio的长读长数据进行基因组拼接，事实上长读长也确实显著降低了Contig数。“但同时我们还在PacBio的建议下观察了碱基修饰，最终发现了亚利桑那疫情爆发株中有一段不同寻常的甲基化转移酶编码基因序列。这个甲基化转移酶并不是个新颖的酶，但它出现在大肠杆菌中就显得有些不同寻常了。”我们会和位于美国内布拉斯加州的另一个USDA ARS中心合作，继续使用PacBio在其他各种爆发菌种中进行全基因组范围的碱基修饰分析。
Rex Malmstrom：
JGI正在用PacBio技术在微生物中进行甲基化谱分析，这些微生物均与生物能源、生物处理、及食物传播性疾病或家畜传染病致病原等领域休息相关。“PacBio系统特别适合于检测5-mC之外的碱基修饰，比如在微生物中6-mA修饰非常普遍，但这种修饰就无法通过传统的亚硫酸氢盐测序检测。我们正在用PacBio对微生物进行全基因组范围内的6-mA分析。”
Lucy Shapiro：
“随着全球人口数量、生态学、人类和动物迁徙活动等的剧烈变化，人们对致病性细菌和病毒的认识需要不断重视并加深，这个趋势刻不容缓，而探索发现微生物的发育和致病机制则是重中之重。PacBio技术为细菌和病毒等的研究打开了一扇全新的大门，它提供了发掘以往无法想象并触及的现象的机会，比如微生物发育和全基因组甲基化的关联。同时，我本人也非常荣幸能成为PacBio公司董事会的成员，并为公司的继续开拓进取尽绵薄之力。”
注: 详情请见参考影像3。
Christopher Mason：
PacBio在微生物上的碱基修饰分析结果令我们备受鼓舞。“我们已经迫不及待地开始在哺乳动物中尝试了。我们的最终目标是希望只通过1-2X覆盖的聚合酶动力学数据就可以得出在哪发生了碱基修饰，以及告诉我们是何种修饰。”
Stephen Turner：
不仅在DNA，我们还在RNA上进行实验，不光给RNA直接测序，还要给RNA判读修饰，因为RNA上含有更多类型的碱基修饰。“我们一直期望SMRT技术可以不断给基因组学和表观遗传学领域带来革新。”
目前拥有两台PacBio RS仪器的美国能源部联合基因组研究所JGI正在使用我们新推出的软件在细菌中进行碱基修饰分析。有消息称，孟山都公司也打算在拟南芥基因组中进行甲基化分析。今后这样的应用例子将会越来越多。
参考文献
1. Direct detection and sequencing of damaged DNA bases. Clark TA, Spittle KE, Turner SW, Korlach J. Genome Integr. 2011 Dec 20;2:10.
http://www.genomeintegrity.com/content/2/1/10
2. Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing. Flusberg BA, Webster DR, Lee JH, Travers KJ, Olivares EC, Clark TA, Korlach J, Turner SW. Nat Methods. 2010 Jun;7(6):461-5.
http://www.nature.com/nmeth/journal/v7/n6/full/nmeth.1459.html
3. Genome-wide mapping of methylated adenine residues in pathogenic Escherichia coli using single-molecule real-time sequencing. Fang G, Munera D, Friedman DI, Mandlik A, Chao MC, Banerjee O, Feng Z, Losic B, Mahajan MC, Jabado OJ, Deikus G, Clark TA, Luong K, Murray IA, Davis BM, Keren-Paz A, Chess A, Roberts RJ, Korlach J, Turner SW, Kumar V, Waldor MK, Schadt EE. Nat Biotechnol. 2012 Dec 7;30(12):1232-9.
http://www.nature.com/nbt/journal/v30/n12/full/nbt.2432.html
4. Origins of the E. coli strain causing an outbreak of hemolytic-uremic syndrome in Germany. Rasko DA, Webster DR, Sahl JW, Bashir A, Boisen N, Scheutz F, Paxinos EE, Sebra R, Chin CS, Iliopoulos D, Klammer A, Peluso P, Lee L, Kislyuk AO, Bullard J, Kasarskis A, Wang S, Eid J, Rank D, Redman JC, Steyert SR, Frimodt-Møller J, Struve C, Petersen AM, Krogfelt KA, Nataro JP, Schadt EE, Waldor MK. N Engl J Med. 2011 Aug 25;365(8):709-17.
http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa1106920
5. Sensitive and specific single-molecule sequencing of 5-hydroxymethylcytosine. Song CX, Clark TA, Lu XY, Kislyuk A, Dai Q, Turner SW, He C, Korlach J. Nat Methods. 2011 Nov 20;9(1):75-7.
http://www.nature.com/nmeth/journal/v9/n1/full/nmeth.1779.html
6. The methylomes of six bacteria. Murray IA, Clark TA, Morgan RD, Boitano M, Anton BP, Luong K, Fomenkov A, Turner SW, Korlach J,Roberts RJ. Nucleic Acids Res. 2012 Dec 1;40(22):11450-62.
http://nar.oxfordjournals.org/content/40/22/11450.long
参考影像
1. Virtual Poster - Detecting Base Modifications with SMRT Sequencing, Jonas Korlach (Pacific Biosciences)
2. Virtual Poster - Detection of Damaged DNA Bases Using SMRT Sequencing, Tyson Clark (Pacific Biosciences)
3. Webinar - Dynamic Chromosome Methylation Controls Cell Cycle Progression, Lucy Shapiro (Stanford University)
4. Webinar - The Role of Adenine Methylation in Determining the Pathogenicity of a Bacteria, Eric Schadt (Mt. Sinai School of Medicine)
生物通往期文章
1. PacBio RS第三代单分子测序系统全球访谈纪要（一）
2. PacBio RS第三代单分子测序系统全球访谈纪要（二）
3. PacBio碱基修饰分析标识微生物、病原菌的表观遗传学标志
4. PacBio推出首款检测DNA碱基修饰的软件[新品推荐]
5. 单分子测序技术助力欧洲大肠杆菌研究[创新技巧]
6. 单分子测序开创甲基化的直接测定
7. 单分子测序灵敏检测5-hmC[创新技巧]
8. 单分子测序助力细菌甲基化组的分析[创新技巧]
