仅仅一个细胞也能开展新一代测序[新品推荐]

在细胞分析中，我们往往采用细胞群体，来获取某个参数的平均值。然而，随着细胞生物学的发展，我们逐渐意识到，平均值已不再能满足我们的要求。对于一些复杂的组织，群体性研究只能获得某些数量上占优势的细胞信息，比如高度异质性的实体瘤组织。同时，还有一些细胞的量极少，如产前诊断中的胎儿细胞或循环肿瘤细胞。当然，别忘了自然界还存在各种各样的微生物。其中，大部分微生物不仅数量有限，也无法用传统的方法扩大培养。对于这些微量细胞的分析，常规的技术显然束手无策。

近年来，流式细胞分选和激光捕获显微切割技术的出现让单细胞的捕获成为可能。不过，在获得目的细胞之后，如何与下游分析技术（如新一代测序和芯片）衔接呢？单个细胞只含有pg级的DNA，细菌更是只有fg级的DNA，但测序或芯片分析通常需要μg甚至mg级的DNA。怎么办？让全基因组扩增来帮忙！

全基因组扩增（whole gemome amplification）是对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列偏向性的前提下大幅度增加DNA的总量。之前人们常用基于PCR的扩增方法（如DOP-PCR和PEP-PCR），但这些方法不能对各个片段进行均匀地扩增，有可能产生扩增假象。因此，目前人们多采用多重置换扩增（MDA）方法。

号称基因组复印机的QIAGEN REPLI-g试剂盒正是基于多重置换扩增技术，对有限的样品进行快速、均匀、无偏向的等温全基因组扩增，从而获得更多遗传信息。原理是什么？请看图1。

 
图1. 多重置换扩增（MDA）技术

在扩增过程中，引物与模板DNA 退火，并利用在DNA 模板链上移动的Phi 29 聚合酶在30°C 延伸，取代互补链，同时自身成为复制的模板。与PCR 扩增不同，MDA 不需要不同的温度，且最终的片段非常长（2-70 kb），突变率低。

之前QIAGEN已有多款REPLI-g试剂盒，而新品REPLI-g Single Cell Kit则是专为单细胞研究人员而设计的。与之前的试剂盒相比，它有两点不同：采用优化配方的高保真Phi 29 聚合酶；增加了UV去污染步骤。

REPLI-g sc 聚合酶是高保真Phi 29 聚合酶的优化配方，具有强的置换活性，可通过多重置换扩增（MDA）扩增复杂的基因组DNA，而温和的碱变性步骤可防止DNA 片段化并产生脱碱基位点。Phi 29 聚合酶确保了基因座的均匀扩增，它最多能复制70 kb 而不与基因组DNA 模板解离，实现了基因座的均匀扩增。Phi 29 聚合酶有着3’ → 5’ 的核酸外切酶校正活性，在复制时其保真度比Taq DNA 聚合酶高出1000 倍，从而避免了扩增偏向或突变。相比之下，那些基于PCR的扩增方法会导致扩增片段短且容易出错，带来单碱基对突变、STR缩小和扩大。

同时，REPLI-g Single Cell Kit 使用专门的缓冲液和试剂，反应设置相当简单，且处理时间仅为15 分钟。这些独特的组分，再加上标准化的UV 处理步骤，能够消除任何可检测到的残留DNA污染，确保高质量结果仅仅来自您那个宝贵的细胞。此试剂盒也可使用已纯化的基因组DNA、新鲜或干燥的血液，以及新鲜或冷冻的组织。

表1. REPLI-g Single Cell Kit的组分

试剂盒组分	优势
REPLI-g sc Polymerase	长达70 kb的长片段 保真度比Taq高1000倍 序列代表性最大化 所有基因座的均匀扩增
REPLI-g sc Reaction Buffer （包括盐、引物和dNTP）	为所有基因座的无偏向扩增和代表而优化
Buffer DLB（裂解和变性）	扩增的高效制备 无DNA损伤过程
UV去污染过程	确保任何残留DNA污染的消除

这下，哪怕只有一个细胞在手，您也可以大胆地开展各种下游分析了吧。经REPLI-g Single Cell扩增后，DNA产物平均长度超过10 kb，产量高达40 μg，且完整覆盖基因组，高度适合也已经开发用于新一代测序（NGS）、芯片法比较基因组杂交（array CGH）或qPCR分析。

图2. 完整的基因组覆盖。利用RT² qPCR Primer Assays（QIAGEN）以及REPLI-g Single Cell Kit 在3 个不同的单细胞实验中扩增DNA 后开展实时定量PCR，对整个人类基因组中分布在不同染色体上的267 个基因座进行全面分析。低且一致的CT 值、无任何标记的丢失，表明基因组中所有区域的成功扩增，高度适合单细胞基因组学。

当然，事实胜于雄辩。东西好不好，用过了才有发言权。好吧，现在请客户来发言。

第一位是华大基因研究员宋卢挺。他之前一直用REPLI-g mini kit，这一次评估了REPLI-g Single Cell Kit。他选用正常的淋巴细胞系样品，分别做了1个无扩增的大量细胞（>1000000个）、1个Qiagen REPLI-g single cell kit单细胞、3个Qiagen REPLI-g mini kit单细胞、1个Qiagen REPLI-g mini kit多细胞（约15细胞）样品的约0.5x全基因组测序。

他认为，相对于原REPLI-g mini kit，新的single cell kit可极大地降低扩增偏向性，实现全基因组较均一的扩增（接近无扩增的效果），使此试剂盒产物有了同时可检测SNP和CNV、SV的可能性。但在Mean Mapping Quality、Read mapping ratio、Read duplicated ratio等数据方面，因原REPLI-g mini kit效果已较好，无变化。

第二位是新加坡基因组研究院的Masafumi Muratani 博士。他谈道：“我已经试过了这个试剂盒，并成功开展了单细胞全基因组扩增。所获得的DNA 让我能可靠检测一个结肠直肠癌细胞系中等位基因特异的点突变。扩增后DNA 的出色产量和序列代表性确实帮助我推进了单细胞基因组学的研究工作。”

有了身边这两位研究人员的现身说法，现在您应该充满信心了吧。如果您恰好在从事癌症研究或宏基因组学研究，那么不妨试试这个新产品。（生物通 余亮）

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