论文昭示儿童转基因大米实验方法

　　

背景介绍： 利用儿童实验的转基因大米论文全文（一）

对象与方法

对象

研究是在中国湖南省的一所小学开展的，对象是年龄在6-8岁的健康小学生（有着正常的生化检测结果；如下），无寄生虫感染，或用阿苯达唑（葛兰素史克）治疗后证实无感染。大部分居民是本地农村的劳动人民，收入中等。48%的研究对象在治疗（无副作用）后被招募，在研究餐开始前的一个月参与研究。因此，研究时的所有研究对象经过实验室检测，均无寄生虫感染。当地每年对所有儿童进行健康评估和生物医学检测（白细胞计数、血红蛋白计数、血小板计数、红细胞计数和红细胞压积）。

为了评估研究的样本大小，我们使用了过去美国的菠菜或β-胡萝卜素胶囊研究（26,27）和中国的深绿色蔬菜研究（28）进行power计算。我们发现，为了确定两个类别的差异——边缘和正常维生素A摄入，我们需要每个类别30个的样本大小，为了评估各种来源的食物机制的效果（菠菜、黄金大米和β-胡萝卜素胶囊），我们需要每组10个。考虑到对象退出研究的可能性，我们提议边缘维生素A组有36个对象，正常维生素A组有36个对象，而菠菜组、大米组和β-胡萝卜素胶囊组每组有12个。

在筛查的总共112个对象中，72个参加了研究，并从68个对象中采集了足够的血清样本（每个对象在1-5个时间点之间变化），便于HPLC和气相色谱-质谱分析。对象的人体测量是在全中国这一年龄组所报告的数据范围内（29）。研究招募过程和实验步骤经过了美国机构审查委员会-塔尔茨医学中心和中国浙江省医学科学院伦理审查委员会的批准。所有家长和学生都同意参加本研究。

内标记植物材料的生产和标记剂量的制备

氘标记的黄金大米（GR）谷粒和菠菜是从一种水培植物系统（位于休斯顿的USDA-农业研究服务儿童营养研究中心）中收集的，用重水（氧化氘，D2O）培养植物，在刚埋入种子（在水稻箱）或种植开始（菠菜）后即引入生长培养基，如之前所述（26）。在成熟期收获GR谷粒，空气干燥3天，随后去壳、研磨并储存在-70℃，直至运输到波士顿煮熟，如之前所述（25）。类似地，菠菜收获后包装新鲜的叶子（用冰），隔天运输到波士顿烹饪和处理，如之前所述（26）。

煮熟的GR被分成60g小份（煮熟重量），装在单个食物容器中，放在-70℃至食用。在吃的当天，GR剂量移至室温，并用蒸汽短暂加热，之后作为午餐提供。

煮熟、标记的菠菜被匀浆、混合，并分成30g小份，装在单个食物容器中，放在-70℃至食用。在吃的当天，菠菜剂量移至室温，并用蒸汽短暂加热，之后作为午餐提供。

纯的2H8-β-胡萝卜素剂量是全反式[2H8] β-胡萝卜素结晶（11,11#,19,19,19,19#,19#,19#-[2H8] β-胡萝卜素），它是由BASF的科学家合成的。化学纯度为91.2%（这一百分比被用于计算剂量中的β-胡萝卜素）。利用梅特勒-托利多的XP-26微量天平称量0.50 mg β-胡萝卜素，其测量可读性达0.001-mg，并用10 mL无水乙醇溶解，再与170 mg玉米油混合形成透明油溶液，从而制成油软胶囊（明胶，尺寸1）中的[2H8] β-胡萝卜素。这些植物食物的β-胡萝卜素富集谱以及研究中的纯β-胡萝卜素是通过液相色谱 – 大气压化学电离质谱分析的，如图1所示。

作为参考剂量，0.5 mg [13C10]维生素A（8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 19, 20- [13C10]视黄醇乙酸酯），其化学纯度为98%，同位素纯度为99%（由剑桥同位素实验室合成），溶于170-mg玉米油明胶胶囊（大小3）中，被志愿者在早餐时摄取。研究剂量与PolarPack冰块一起置于冰盒中，预冷到-70℃，运输到中国的研究地点，其中剂量被放置在-20℃，在食用前不久取出。

研究设计

对象被随机分配（利用计算机生成的随机号码表）到食用菠菜、GR或β-胡萝卜素油软胶囊。整个研究持续了35天，包含了一个14天的食物制备阶段，在此期间，儿童（无寄生虫感染）试吃了厨房提供的研究膳食，并且在此期间，父母被告知孩子的饮食限制。整个研究还包含了一个dosing day（第0天）以及一个21天的周期，从每个对象中最多抽取5个血液样品，以研究血液反应曲线。细节如图2所示。

在研究第0天的0700-0800，儿童摄入了[13C10]维生素A（0.5 mg）及10 mL豆奶，他们的标准化早餐包含米粉（200g、煮熟）、猪肉（110g、煮熟）、半个苹果和26-g曲奇饼干。这一餐的总能量为630 kcal，其中20%来自脂肪。标准化午餐在1145与1230之间，包含大米（250 g、煮熟）、猪肉（100 g、煮熟）、卷心菜（100 g、煮熟）、番茄蛋汤（100 g），其总能量约为560 kcal，其中20%来自脂肪，由研究对象与研究剂量的菠菜（30 g）、一颗β-胡萝卜素胶囊或GR（60 g）一起摄入。对于菠菜或β-胡萝卜素小组，在午餐中还加入了适当量的白米饭，以确保热量与60-g GR小组相同。根据整个小组的食物记录，每个人平均每天从对象的日常膳食中摄入的维生素A约为240 μg视黄醇，为此年龄组的中国营养素建议摄入量700 μg视黄醇的34%。在3周的研究过程中，对象每周5天全在学校吃饭。在家吃饭时，建议不给富含维生素A或维生素A原的食物（如肝脏、过量的胡萝卜）。周末所吃的食物被记录在带回家的日记上。

在实验阶段的第1、3、7、14和21天早上试图从每个对象中抽取空腹血液样本（3 mL，某些对象较少）（图2），根据之间的描述进行分析（26）。

（生物通 薄荷）

结果： 利用儿童实验的转基因大米论文全文（三）

分析： 利用儿童实验的转基因大米论文全文（四）