SYBR法实时定量PCR优化指南

SYBR Green法实时定量PCR比探针法成本低，使用也更为方便。不过该方法也存在着与生俱来的弊端，SYBR Green法产生的非特异性产物较多，会导致高背景和假阳性。当然供应商们也各展所长，开发了各式各样的产品来帮您优化这一qPCR的经典方法。

SYBR® Green是一种插入DNA分子的染料，具有多种分子生物学应用，其中之一就是用于实时定量PCR（qPCR）。随着PCR循环的连续进行，这种染料的荧光强度会不断增强，从而可以使人们对反应中的DNA进行定量。SYBR Green法及一些其他基于染料的qPCR方法比探针法的成本低，使用也更为方便。不过这些方法也存在着与生俱来的弊端，SYBR Green方法产生的非特异性产物较多，会导致高背景和假阳性。尽管如此，SYBR Green法这一久经考验的技术仍然颇为流行，有大量的研究人员是SYBR Green法的忠实拥护者，愿意接受这一技术的小瑕疵。当然供应商们也各展所长，开发了各式各样的产品来帮您优化这一qPCR的经典方法。

热启动的长处

热启动PCR方法能够在反应开始前避免非特异性扩增。热启动技术一般是依赖经修饰的酶、引物或者抗体对聚合酶进行抑制，直到系统达到变性温度。

Sigma公司生命科学部qPCR试剂全球产品经理Eric Reyes称，该公司最新的热启动产品KiCqStart™ SYBR Green qPCR ReadyMix™比同类产品性能更优，并且可以针对如今试验室中的各类实时定量PCR仪提供相应配方的产品。KiCqStart SYBR Green ReadyMix产品是2X浓度的即用型试剂，包括SYBR Green I、抗体介导的热启动Taq DNA聚合酶、核苷酸和MgCl2，外加缓冲液和稳定剂。该产品只需客户加入引物和模版，免去了繁复的SYBR Green优化流程，实际上该产品也的确不需要进行优化。

较难扩增的目标

有些目标较难扩增，为了解决这一问题，Life Technologies公司近期发布了SYBR Select Master Mix。依据Life Technologies基因分析产品主管Sobha Pisharody的说法，该产品的最大优势在于特异性和可重复性更高，超越了目前市面上的其他SYBR混合液。SYBR Select包括一个热不稳定性尿嘧啶糖基化酶UDG，用于去除可能干扰扩增的污染模板。“混合液中含有UDG可能造成一些问题，”Pisharody说。“有时甚至会破坏反应，因为它并不总能一受热就灭活。”

dUTP的利与弊

扩增产物有时会影响后续PCR反应，导致假阳性结果。控制这种情况的方法之一就是在PCR产物中用dUTP取代dTTP，随后再用UDG处理所有的后续反应。UDG能够将尿嘧啶从其磷酸二酯主干上切除下来，但不影响天然DNA。

热不稳定性UDG在完成清理任务后，可以受热自动失活。“这一产品能使客户的实验更容易获得成功，”Pisharody说。“客户使用SYBR遇到的主要问题之一，是需要反复进行引物设计、试验、重新设计引物，而这一混合液的特异性可以帮助人们大大简化这一过程。”

不过，dUTP方法也存在着缺陷。只有当同一个仪器上的所用用户都使用dUTP清理系统时，该方法才有效。即使该研究组中只有一位成员不使用dUTP清理系统，这种控制方法就会失效。此外使用dUTP被认为是一种低效率的方法，因为dUTP会使反应的效率降低，Ct值增大。

Meridian生命科学公司旗下的Bioline就因此不再销售带有dUTP的PCR试剂盒。该公司向用户推荐了一种优化步骤，包括使用一次性耗材、带过滤芯的吸头以及分隔扩增区域，将洁净的实验室操作与高特异性的实时定量PCR联系起来。Bioline的SensiFAST™系列试剂盒不仅提供用于SYBR Green法的实时定量PCR产品，同样也提供探针法产品供您选择。

快、还要更快

目前，许多实验室都在寻求qPCR的快速方案，例如将两小时的实验方案缩短至45分钟或者1小时。快速PCR通常意味着价格水涨船高的仪器和不菲的资金投入，不过其实调整标准仪器的参数也能够实现快速PCR，例如可将qPCR的标准三步流程合并为两步（合并退火和延伸过程）。而相应的试剂和耗材（例如新型热启动酶）也能帮您进一步节省时间。

Bio-Rad公司的SsoAdvanced™ SYBR Green supermix中包含与双链DNA结合的蛋白Sso7d融合酶，这种酶能够稳定聚合酶-模板复合物，提高PCR反应的持续合成能力、抑制剂耐受力和反应速度。Bio-Rad的资料显示，这一混合液能够提高qPCR的速度而不会对反应的特异性、敏感性和效率产生丝毫影响。

此外，Bio-Rad公司还提供iTaq™ Universal SYBR Green Supermix。“这种SYBR Green supermix的优势在于，它的仪器兼容性非常广泛，并且能够在多种反应条件下生成优异的qPCR数据，”Bio-Rad 的PCR试剂产品经理Ramesh Sathiyaa介绍道。

Thermo Scientific公司的DyNAmo™ Flash SYBR Green qPCR试剂盒也是一款专门为快速PCR设计的产品。该产品依赖于经过修饰的Thermus brockianus DNA聚合酶，将这种酶的热启动版与SYBR Green I染料相结合。该公司的技术人员通过非特异性DNA结合域的融合使T. brockianus聚合酶更加稳定性，并且在室温下不具活性。该试剂盒的ColorFlash版更整合了特殊染料，其中master mix含有蓝色染料针，而样品缓冲液含黄色染料（样品孔），这样当样品和master mix混合后就会呈现绿色。这一颜色体系可以确保移液的正确性，帮您轻松告别加样失误。

替代品

罗氏公司的技术服务顾问Joe Donnehoffer正在尝试引导客户放弃SYBR Green，“如果客户正在使用SYBR Green并且需求用于降低非特异性的产品，我们会推荐他们使用UPL通用探针库”。

Donnehoffer还向强烈执着于SYBR Green的客户推荐了一款替代性染料，LightCycler 480 ResoLight Dye。与SYBR Green不同，ResoLight能够充满DNA分子片段，生成准确的熔解曲线。而SYBR Green I分子就无法做到这一点，染料分子在解链阶段会在DNA链之间“跳跃”。

Donnehoffer也提到人们对于SYBR Green的偏爱可能较难改变。“使用SYBR Green的客户……并不情愿采用另一种不同的方法。”因此，他也并不指望SYBR Green会在近期退出实验室的应用舞台。

Life Technologies公司也有相应的替代性染料提供，该公司的SYBR GreenER™比SYBR Green I更亮，对PCR反应的抑制也更小。

预证引物

正所谓成也萧何败萧何，引物设计在一个qPCR实验中非常关键。实际上您可以在引物数据库中寻找适合自己的引物设计，这类数据库包括RTPrimerDB、PrimerBank和qPrimerDepot等，其中的引物设计都是被验证过的。

市面上也有不少预证引物的产品。例如Qiagen公司的QuantiTect Primer Assay就是特别为SYBR Green法设计的qPCR引物对，具有高度的敏感性和特异性，PCR效率能达到100%。该产品系列覆盖了人类、大鼠、小鼠、果蝇、拟南芥等物种的基因，更经过专家的反复验证和优化，与Qiagen公司的QuantiFast、QuantiTect、Rotor-Gene或者FastLane SYBR Green试剂盒一同使用实验结果就更有保障了。根据Qiagen公司的资料，即使在标准qPCR仪上使用，QuantiFast SYBR Green试剂盒也能帮您省下60%的时间。

OriGene公司也有预证引物产品提供，其SensiMix qPCR引物对就能用于SYBR Green法qPCR，该产品也是OriGene公司独有专利算法的结晶。OriGene公司的预证引物产品覆盖了人类和小鼠的整个基因组。

此外，Sigma公司也发布了为人类、小鼠和大鼠转录组设计的KiCqStart预证引物，Sigma公司OEM、分子诊断和qPCR探针的全球产品经理Tom Russell介绍道。这些引物比市面上的其他预证引物更经济，购买该产品也更为便利，“我们在世界各地都设有生产机构，”Russell说。

在qPCR复杂冗长的优化过程中，往往需要不断进行实验，逐步改进引物设计，甚至重复订购试剂，不知不觉就耗费了我们大量的时间和精力，从这方面看预证引物和试剂盒绝对是物超所值。

（Catherine Shaffer撰写/yeyu编译）